Enzyme Immunoassay Reagent Kit

1

Kit de réactifs pour dosage immunoenzymatique

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

2

Kit di Reagenti per Saggio Immunoenzimatico

Enzyme Immunoassay Reagent Kit

The activation of leukocytes prompts the secretion of MPO and the generation of oxidants.1 Several lines of evidence suggest that the enzyme myeloperoxidase (MPO), secreted by the leukocytes, participates in atherosclerotic progression and contributes to plaque vulnerability.2,3 MPO has been linked to the development of lipid-laden soft plaque, the activation of protease cascades affecting the stability and thrombogenicity of plaque, the production of cytotoxic and prothrombogenic oxidized lipids, and the consumption of nitric oxide, leading to vasoconstriction.3

The plasma MPO concentration in patient samples acquired during the period of assessment for acute coronary syndrome in the Emergency Department predicts the risk of major adverse cardiac events (MACE); i.e. myocardial infarction, need for revascularization or death, over the next 30-day and 6-month interval.2 The odds ratio for MACE increases with increasing levels of plasma MPO in all quartiles of the population. The predictive power of the MPO concentration is independent of age, gender, race, CRP level, Troponin T level, CK-MB level, history of diabetes, history of smoking, history of hyperlipidemia, and history of hypertension.

4

Calibrators are added directly to the appropriate wells of the Microtiter Plate. Assay Buffer is added to all wells that are intended for Control or sample analysis. Aliquots of Controls or samples are added to the appropriate wells and the plate is incubated for 45 minutes at 20-26°C. The wells are then washed with Wash Buffer to remove antigens not specifically bound to the immobilized antibody.

An anti-MPO monoclonal antibody labeled with the enzyme horseradish peroxidase (HRP) is then added to each well and incubated for 45 minutes at 20-26°C. This conjugated antibody binds to the MPO captured on the plate, and the MPO in the sample is “sandwiched” between the antibody on the solid phase and the antibody conjugate. The plate is again washed with Wash Buffer to remove unbound HRP-labeled antibody.

The substrate, tetramethylbenzidine (TMB), is then added to each well and incubated for 15 minutes at 20-26°C resulting in the development of a blue color. Color development is stopped with the addition of Stop Solution, changing the color to yellow.

The enzymatic turnover of the substrate is determined spectrophotometrically at 450 nm, preferably with correction at 630 nm, and is directly proportional to the concentration of MPO. The absorbances of the Calibrators are used to plot a calibration curve of absorbance versus MPO concentration from which the MPO concentration in the Controls or samples can be determined.

Microtiter plate coated with a mouse monoclonal antibody specific to MPO, 12x8-well strips.

Citrate buffered saline containing detergents and additives.

Yellow solution of a mouse monoclonal antibody specific to MPO conjugated to HRP.

Solution of sulfuric acid (0.4N) in water. Keep tightly capped.

Tris-buffered saline containing detergents.

5

6

Unopened test kits should be stored refrigerated (2-8 °C) upon receipt and until the expiration date. Unused microtiter stripwells should be stored sealed in the foil pouch with desiccant at 2-8 °C. When stored as directed, unopened test kits will remain stable until the expiration date indicated on the label. Do not use any reagents that show indications of discoloration, cloudiness, precipitation, or leakage.

Procedural Notes

1. Allow reagents, samples, Calibrators and Controls to warm to room temperature (20–26°C) for at least 30 minutes before use.

2. Vortex the samples, Calibrators, and Controls to mix thoroughly. Avoid foaming.

3. Remove the stripwell frame and required number of coated microtiter strips from the foil pouch after bringing the plate to room temperature (20–26°C). Place any unused stripwells in the foil pouch with the enclosed desiccant, reseal, and store at 2-8ºC.

4. Use a new polypropylene pipette tip for each reagent, Calibrator, Control, or sample to prevent contamination.

5. All Calibrators, Controls, and samples should be run in duplicate.

6. Prior to the addition of Anti-MPO Antibody Conjugate and TMB Substrate Reagent, ensure that there is no residual Wash Buffer in the wells. Any remaining Wash Buffer may cause variation in test results.

7

7. For accurate measurement, the addition of samples, Calibrators, and Controls must be precise. Pipet carefully using only calibrated equipment.

8. All kit components, except Wash Buffer Concentrate, are supplied ready to use. Refer to the following procedure for preparing Working Wash Buffer solution.

1X Working Wash Buffer Preparation

Allow Wash Buffer Concentrate to come to room temperature (20–26°C) prior to use. Prepare 1X Working Wash Buffer by pouring a bottle of the provided 25X Wash Buffer Concentrate into a clean one liter vessel. Rinse the bottle with Type I deionized water to remove residual buffer and dissolve crystals. Add the rinse, dilute with Type I deionized water to a total volume of 1.0 liter and mix thoroughly. When stored at 2-8°C, 1X Working Wash Buffer is stable for up to two months.

Plate Preparation

Sample Incubation

3. Blot the plate on absorbent paper towels after the final wash to remove any remaining Wash Buffer. Do not allow wells to dry. Proceed immediately to next step.

Antibody Conjugate Incubation

4. Blot the plate on absorbent paper towels after the final wash to remove any remaining Wash Buffer. Do not allow wells to dry. Proceed immediately to next step.

8

Substrate Incubation and Color Development

Stop and Reading

2. Gently swirl the plate on a flat surface to mix. Ensure that the blue color has completely changed to yellow.

3. Read the optical density at 450 nm using a microtiter plate reader. Background correction at 630 nm is recommended.

1. Construct a calibration curve using appropriate computer software. A four-parameter curve fit is recommended. Manual calculations can be performed by plotting the mean absorbance obtained for each Calibrator on the y-axis versus the MPO concentration (pmol/L) on the x-axis.

2. Using the mean absorbance value for each sample and Control, determine the corresponding concentration of MPO in pmol/L from the calibration curve. The MPO level assigned for each Calibrator reflects the use of the 10 μL sample size (a 1:10 dilution in the plate) so no further calculation is required.

3. Samples with MPO levels exceeding the value of the highest Calibrator may be reported as greater than that level, e.g. > 8000 pmol/L. Further dilution of samples is not recommended.

9

Results of a typical calibration curve using O.D. readings at 450 nm with correction at 630 nm are shown on the y-axis against MPO concentrations (pmol/L) shown on the x-axis. The user should generate a new calibration curve with each test performed. The following calibration curve is for illustration purposes only.

A

8020

2.630

B

3650

2.000

C

1580

1.108

D

490

0.346

E

0

10

Procedure

Clinical Interpretation

The median MPO level for subjects in the adjusted database was 340 pmol/L and the range of results was 137 to 984 pmol/L. The non-parametric distribution of myeloperoxidase levels in this normal population yields a two-tailed central 95% reference interval, corrected for the influence of outlier rejection, of 156 – 734 pmol/L. However, in this application the more appropriate single-tailed lower 95% reference interval, again corrected for the influence of the outlier rejection method, is < 640 pmol/L.

Sensitivity

The minimum detection limit, as calculated by interpolation of the mean plus two standard deviations of 26 replicates of the 0 pmol/L MPO Calibrator (E), is 14 pmol/L MPO.

11

Assay Precision

Total and within-run precision were determined by testing 6 Lithium Heparin Plasma Test Samples with MPO concentrations distributed throughout the calibration range of the assay, according to CLSI (formerly NCCLS) guideline EP5-A. These samples were assayed in duplicate, using a single lot of reagents and Calibrators, on two separate plates per day, for twenty days. A new calibration curve was run in duplicate on each plate. The results of the precision study are summarized in the following table.

Lithium heparin plasma Sample 1

307

80

10.2%

5.8%

Lithium heparin plasma Sample 2

610

80

5.8%

5.0%

Lithium heparin plasma Sample 3

1285

76*

7.4%

5.7%

Lithium heparin plasma Sample 4

1459

80

8.9%

8.6%

Lithium heparin plasma Sample 5

2745

80

9.0%

9.0%

Lithium heparin plasma Sample 6

4758

80

8.7%

6.4%

Average

8.3%

6.7%

* 1 days worth of data was excluded from analysis due to gross outliers

Linearity

Spiking recovery

Nine lithium heparin plasma samples were spiked with 497, 1456, and 2851 pmol/L MPO and analyzed for recovery. The percent recovery was calculated by dividing the mean measured MPO concentration of the spiked sample by the expected MPO concentration, where the expected MPO concentration was the sum of the measured MPO concentration in the neat plasma sample and the concentration of the MPO spike. The average recovery of spiked MPO in lithium heparin plasma ranged from 87% to 117% with a mean of 100.7%.

12

Dilution recovery

Nine lithium heparin plasma samples were spiked with 2851 pmol/L MPO and diluted 1:2, 1:4, and 1:8 with Assay Buffer. The percent recovery was calculated by dividing the mean MPO concentration of the pre-diluted sample multiplied by the dilution factor by the mean MPO concentration of the sample with no pre-dilution. The mean recovery of a 1:2 dilution was 113% for lithium heparin plasma, with recoveries ranging from 107% to 117%

Cross-reactivity

The potential cross-reactants shown in the following table were tested in lithium heparin plasma and Assay Buffer, according to NCCLS guideline EP7-A. All investigated proteins exhibited less than 0.007% cross-reactivity at the high test concentration and less than 1.7% cross-reactivity at the low test concentration when added to a lithium heparin plasma pool.

Substance tested

Concentrations tested (nmol/L)

1250, 125, 12.5

C-reactive protein, human

543, 54.3, 5.43

Lysozyme, human

4464, 446.4, 44.64

IgA, human

417, 41.7, 4.17

Elastase, human

2500, 250, 25

Eosinophil Peroxidase, human

887, 88.7, 8.87

Lactoperoxidase, bovine

801, 80.1, 8.01

Lactoferrin, human

781, 78.1, 7.81

COX1, ovine

893, 89.3, 8.93

COX2, human

868, 86.8, 8.68

Thyroid peroxidase, human

595, 59.5, 5.95

Troponin I, human

2155, 215.5, 21.55

13

Interfering Substances

The substances shown in the following table, when tested in plasma containing 3000 pmol/L and 1000 pmol/L MPO according to NCCLS guideline EP7-A, were found not to interfere up to the concentrations indicated. Bias of 10% or less was not considered interference.

Acetylsalicylic acid

600

Toxic dose

Albumin

50000

High*

Amoxicillin

75

3x therapeutic dose

Bilirubin, conjugated

50

High*

Bilirubin, unconjugated

150

High*

Captopril

5

Toxic dose

Ceruloplamin

600

High

Cholesterol

1000

High*

DNA

16.7

High

Fenofibrate

45

3x therapeutic dose

Hemoglobin

5000

Hemolysis*

Heparin, lithium

3000 U/L

3x therapeutic dose

Hydrochlorothiazide

6

3x therapeutic dose

Hydrocortisone

0.69

Toxic dose

Ibuprofen

500

Toxic dose

Indomethacin

36

2x therapeutic dose

Isosorbide dinitrate

0.15

3x therapeutic dose

Lovastatin

53

2x therapeutic dose

Methotrexate

160

Therapeutic dose

Metoprolol

5

Toxic dose

Naproxen

500

4x therapeutic dose

Niacin

0.5

5x therapeutic dose

Nifedipine

0.4

2x therapeutic dose

Salicylic acid

600

Toxic dose

Sodium azide

0.50%

5x preservative dose

Triglycerides

5000

Lipemia

* High level of interfering substance per NCCLS EP7-A

Hook

14

Interfering Antibodies

Multivariate logistic-regression models (SAS version 8.0, SAS Institute) were developed to calculate odds ratios and 95% confidence intervals. The adjusted covariates were age, gender, race, Troponin T (≤0.03 ng/mL vs. >0.03 ng/mL)7, C-reactive Protein (<1 mg/L, 1-3 mg/L, >3 mg/L)2, CK-MB (≤8.8 ng/mL vs. >8.8 ng/mL)7, history of smoking, history of diabetes, history of hypertension, and history of high cholesterol. Missing covariate information on some subjects reduced the study population. The risk of MACE in all patients in the ensuing 30-day period increased with increasing quartiles of myeloperoxidase levels.

Similar analysis of patients that were persistently negative for Troponin T (≤0.03 ng/mL) also revealed a significantly higher risk of MACE for patients with plasma MPO levels in higher quartiles. Adjusted odds ratios and the percentage of patients within an MPO quartile with and without MACE at 30 days are shown in the following graphs and tables.

15

1.0

2.5

2.8

3.3

NA

1.3-4.8

1.5-5.6

1.7- 6.4

p = 0.007

p = 0.0021

p < 0.001

*In each analysis the first quartile served as the reference group

1.0

3.4

4.1

6.9

NA

1.2-9.4

1.5-11.4

2.5-19.2

p = 0.0194

p =0.007

p < 0.001

*In each analysis the first quartile served as the reference group

It should be noted that different cut-off points may be appropriate for different clinical populations.

16

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, et al. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall E, Perlman P. Immunochemistry, 1971 8(9): 871-874.

5. CLSI (formerly NCCLS). CLSI Document H18-A2 1999 CLSI Wayne, PA.

6. Horn, et al. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

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Enzyme Immunoassay Reagent Kit

1. Allow all reagents, Calibrators, Controls, and patient samples to warm to room temperature (20-26°C) for at least 30 minutes prior to use.

2. Vortex Calibrators, Controls, and samples to mix thoroughly.

4. Pipet 90 μL of Assay Buffer into all sample and Control microtiter wells.

6. Seal and incubate for 45 minutes, rotating at 500 rpm.

7. Wash 4 times with 400 μL Working Wash Buffer and blot to remove excess buffer.

8. Add 100 μL Anti-MPO Antibody Conjugate (yellow) to each well.

9. Seal and incubate 45 minutes, rotating at 500 rpm.

10. Wash 4 times with 400 μL Working Wash Buffer and blot to remove excess buffer.

11. Add 100 μL TMB Substrate Reagent to each well.

12. Incubate 15 minutes, rotating at 500 rpm.

13. Add 100 μL Stop Solution to each well and swirl to mix.

14. Read the absorbance at 450 nm, preferably with correction at 630 nm.

Calibrators and Controls may need to be positioned differently based on the number of samples assayed.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

CAL A

2

6

9

13

17

20

24

28

CTL3

35

39

B

CAL B

3

7

10

14

18

21

25

29

CTL3

36

40

C

CAL C

3

CTL1

10

14

18

21

25

29

32

36

40

D

CAL D

4

CTL1

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL A

E

CAL E

4

7

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL B

F

1

5

8

12

16

20

23

27

31

34

38

CAL C

G

1

5

8

12

16

CTL2

23

27

31

34

38

CAL D

H

2

6

9

13

17

CTL2

24

28

32

35

39

CAL E

18

La activación de los leucocitos induce la secreción de mieloperoxidasa y la generación de oxidantes.1 Varias líneas de pruebas clínicas sugieren que la enzima mieloperoxidasa (MPO), secretada por los leucocitos, participa en la progresión aterosclerótica y contribuye a la vulnerabilidad de las placas.2,3 Se ha vinculado la MPO con la aparición de placas blandas cargadas de lípidos, la activación de cascadas de proteasas que afectan a la estabilidad y la trombogenia de la placa, la producción de lípidos oxidados citotóxicos y protrombógenos, y el consumo de óxido nítrico, que lleva a la vasoconstricción.3

La concentración plasmática de MPO en las muestras de pacientes adquiridas en el período de evaluación de un síndrome coronario agudo en el servicio de urgencias predice el riesgo de episodios cardíacos adversos mayores (ECAM), es decir, infarto de miocardio, necesidad de revascularización o muerte, en el siguiente intervalo de 30 días y de seis meses.2 La razón de posibilidades de las ECAM aumenta al aumentar las concentraciones plasmáticas de mieloperoxidasa en todos los cuartiles de la población. El poder predictivo de la concentración de MPO depende de la edad, el sexo, la raza, la concentración de CRP, la concentración de troponina T, la concentración de CK-MB, y los antecedentes de diabetes, tabaquismo, hiperlipidemia e hipertensión.

19

Los calibradores se añaden directamente a los pocillos correctos de la microplaca de titulación. La solución amortiguadora del análisis se añade a todos los pocillos indicados para el análisis de los controles o de la muestra. Se añaden alícuotas de control o muestra a los pocillos correspondientes y la placa se incuba durante 45 minutos a una temperatura de 20 a 26 ºC. A continuación, los pocillos se lavan con solución amortiguadora de lavado, para eliminar los antígenos que no se hayan unido específicamente al anticuerpo inmovilizado.

Luego, se añade a cada pocillo anticuerpo monoclonal anti-MPO, marcado con la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incuba durante 45 minutos a una temperatura de 20 a 26 °C. Este anticuerpo conjugado se fija a la MPO capturada en la placa, y se forma un "sándwich" con la MPO presente en la muestra, entre el anticuerpo de la fase sólida y el conjugado de anticuerpo. La placa se vuelve a lavar con solución amortiguadora de lavado para eliminar el anticuerpo marcado con HRP que se haya unido.

Seguidamente, se añade a cada pocillo el sustrato, tetrametilbenzidina (TMB), y se incuba durante 15 minutos a 20 a 26 °C, lo que causa el revelado de un color azul. El revelado del color se detiene con la adición de la solución de parada, que cambia el color a amarillo.

El recambio enzimático del sustrato se determina mediante espectrofotometría a 450 nm, preferiblemente con corrección a 630 nm, y es directamente proporcional a la concentración de MPO. Las absorbancias de los calibradores se emplean para trazar una curva de calibración de absorbancia frente a concentración de MPO, desde la cual se puede determinar la concentración de MPO en los controles o en las muestras.

Microplaca de titulación recubierta con anticuerpo monoclonal específico de la MPO, 12 tiras de 8 pocillos cada una.

Solución salina amortiguada con citrato, que contiene detergentes y aditivos.

Solución amarilla de un anticuerpo monoclonal específico de la MPO, conjugado con HRP.

20

Solución salina amortiguada con Tris, que contiene detergentes.

21

Los equipos de prueba sin abrir deberán mantenerse refrigerados (2 a 8 ºC) a su llegada y hasta la fecha de caducidad. Las tiras de pocillos de las microplacas sin usar deberán guardarse selladas en la bolsa de aluminio, con desecante, a una temperatura de 2 a 8 ºC. Si los equipos de análisis sin abrir se almacenan según las instrucciones, permanecerán estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. No usar ningún reactivo que muestre signos de decoloración, turbidez, precipitación o derrame.

Notas sobre el procedimiento

1. Dejar que los reactivos, las muestras, los calibradores y los controles se calienten a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC) durante 30 minutos por lo menos, antes de su uso.

2. Agitar las muestras, los calibradores y los controles en vórtice, para que se mezclen bien. Evítese la formación de espuma.

3. Retirar de la bolsa de aluminio el marco de las tiras de pocillos y el número necesario de tiras de microtitulación recubiertas, después de llevar la placa a temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC). Colocar las tiras de pocillos sin usar en la bolsa de aluminio, con el desecante; volver a cerrar herméticamente conservar a una temperatura de 2 a 8 °C.

4. Usar una punta de polipropileno nueva para cada reactivo, calibrador, control o muestra, para evitar la contaminación.

5. Todos los calibradores, controles y muestras deberán analizarse por duplicado.

6. Antes de añadir el conjugado de anticuerpo anti-MPO y el reactivo de sustrato de TMB, asegurarse de que no queden restos de solución amortiguadora de lavado en los pocillos. Los restos de solución amortiguadora de lavado pueden producir una variación de los resultados de la prueba.

7. Para una determinación exacta, la adición de muestras, calibradores y controles debe ser precisa. Pipetear con cuidado, usando exclusivamente un equipo calibrado.

8. Todos los componentes del equipo, salvo el concentrado de solución amortiguadora de lavado, se entregan listos para usar. Consultar el siguiente procedimiento para la preparación de la solución amortiguadora de lavado.

Preparación de la solución amortiguadora de lavado de trabajo 1X

Antes de usar, dejar que el concentrado de solución amortiguadora de lavado alcance la temperatura ambiente (de 20 a 26 °C). Preparar solución amortiguadora de lavado de trabajo 1X vertiendo un frasco del concentrado de solución amortiguadora de lavado 25X en un recipiente limpio de un litro. Aclarar el frasco con agua desionizada tipo I para eliminar los restos de solución amortiguadora y disolver los cristales. Añadir el aclarado, diluir con agua desionizada tipo I hasta un volumen total de 1,0 litros y mezclar bien. Si se conserva a una temperatura de 2 a 8 ºC, la solución amortiguadora de lavado de trabajo 1X permanece estable hasta dos meses.

23

Preparación de las placas

Incubación de la muestra

3. Secar la placa en toallas de papel absorbente después del lavado final para eliminar los restos de solución amortiguadora de lavado. No dejar que los pocillos se sequen. Pasar inmediatamente al siguiente paso.

Incubación con el conjungado de anticuerpo:

4. Secar la placa en toallas de papel absorbente después del lavado final para eliminar la solución amortiguadora de lavado restante. No dejar que los pocillos se sequen. Pasar inmediatamente al siguiente paso.

Incubación del sustrato y revelado del color

Parada y lectura

2. Girar la placa con cuidado sobre una superficie plana para mezclar. Asegurarse de que el color azul haya cambiado completamente a amarillo.

3. Leer la densidad óptica a 450 nm con un lector de microplacas de titulación. Se recomienda una corrección de fondo a 630 nm.

24

1. Trazar una curva de calibración usando el programa informático adecuado. Se recomienda un ajuste de la curva de cuatro parámetros. Pueden hacerse cálculos manuales mediante el trazado de la absorbancia media obtenida con cada calibrador en el eje Y, frente a la concentración de MPO (pmol/l) en el eje X.

2. Con el valor de absorbancia media de cada muestra y control, determinar la concentración correspondiente de MPO en pmol/l, a partir de la curva de calibración. La concentración de MPO asignada a cada calibrador refleja el empleo de 10 μl de muestra (una dilución a 1:10 en la placa), de modo que no se requieren más cálculos.

3. Las muestras con concentraciones de MPO superiores al valor del calibrador más alto pueden notificarse como superiores a dicha concentración, por ejemplo, >8000 pmol/l. No se recomienda diluir más las muestras.

25

Resultados de una curva de calibración típica con las lecturas de D.O. a 450 nm, corrección a 630 nm, en el eje Y, frente a las concentraciones de MPO (pmol/l) en el eje X. El usuario deberá generar una nueva curva de calibración con cada prueba realizada. La siguiente curva de calibración se presenta sólo con fines ilustrativos.

A

8020

2,630

B

3650

2,000

C

1580

1,108

D

490

0,346

E

0

26

Procedimiento

Interpretación clínica

La mediana de la concentración de MPO en los pacientes del banco de datos ajustado fue de 340 pmol/l y los límites de los resultados fueron 137 y 984 pmol/l. La distribución no paramétrica de las concentraciones de mieloperoxidasa en esta población normal da un intervalo de referencia del 95%, central y bilateral, con corrección del efecto del rechazo de los valores aberrantes, de 156 a 734 pmol/l. Sin embargo, en esta aplicación, el intervalo inferior de referencia del 95%, unilateral y más adecuado, también con corrección del método de rechazo de valores aberrantes, es < 640 pmol/l.

27

Sensibilidad

El límite mínimo de detección, calculado mediante la interpolación de la media más dos desviaciones típicas de 26 duplicados del calibrador de MPO a 0 pmol/l (E), es de 14 pmol/l de MPO.

Precisión del análisis

Se determinó la precisión total e intra-análisis mediante el examen de seis muestras de prueba de plasma con heparina litio con concentraciones de MPO distribuidas en todo el intervalo de calibración del análisis, según la directiva EP5-A del CLSI (antiguamente NCCLS). Estas muestras se analizaron por duplicado, con un solo lote de reactivos y calibradores, en dos placas separadas al día, durante 20 días. Se analizó una nueva curva de calibración por duplicado en cada placa. Los resultados del estudio de precisión se resumen en el siguiente cuadro.

Muestra 1 de plasma con heparina litio

307

80

10,2%

5,8%

Muestra 2 de plasma con heparina litio

610

80

5,8%

5,0%

Muestra 3 de plasma con heparina litio

1285

76*

7,4%

5,7%

Muestra 4 de plasma con heparina litio

1459

80

8,9%

8,6%

Muestra 5 de plasma con heparina litio

2745

80

9,0%

9,0%

Muestra 6 de plasma con heparina litio

4758

80

8,7%

6,4%

Promedio

8,3%

6,7%

* Se excluyó del análisis 1 día de datos debido a valores aberrantes grandes.

Linealidad

28

Recuperación de las cantidades conocidas añadidas

A 9 muestras de plasma con heparina litio se les añadieron 497, 1456 y 2851 pmol/l de MPO, y se analizó la recuperación. Se calculó el porcentaje de recuperación dividiendo la concentración media determinada de MPO de la muestra a la que se añadieron cantidades conocidas por la concentración esperada de MPO, donde esta concentración esperada de MPO fue la suma de la concentración determinada de MPO en la muestra de plasma limpio y la concentración de la MPO con cantidades añadidas. La recuperación promedio de la MPO con cantidades añadidas en el plasma con heparina litio varió entre el 87% y el 117%, con una media del 100,7%.

Recuperación de la dilución

A 9 muestras de plasma con heparina litio se les añadió 2851 pmol/l de MPO, y se diluyeron a 1:2, 1:4 y 1:8 con solución amortiguadora de análisis. Se calculó el porcentaje de recuperación dividiendo la concentración media de MPO de la muestra prediluida, multiplicada por el factor de dilución, por la concentración media de MPO de la muestra sin predilución. La recuperación media de una dilución 1:2 fue del 113% en el caso del plasma con heparina litio;las recuperaciones variaron entre el 107% y el 117%.

29

Reactividad cruzada

Los posibles componentes con reacción cruzada que se muestran en el siguiente cuadro fueron examinados con plasma con heparina litio,según la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS). Todas las proteínas investigadas presentaron una reactividad cruzada inferior al 0,007% a la concentración de análisis más alta, y una reactividad cruzada inferior al 1,7% a la concentración de análisis más baja, cuando se añadió a un grupo de plasmas con heparina litio.

Sustancia examinada

Concentraciones examinadas (nmol/l)

1250, 125, 12,5

Proteína C reactiva, humana

543, 54,3, 5,43

Lisozima, humana

4464, 446,4, 44,64

IgA, humana

417, 41,7, 4,17

Elastasa, humana

2500, 250, 25

Peroxidasa de eosinófilos, humana

887, 88,7, 8,87

Lactoperoxidasa, bovina

801, 80,1, 8,01

Lactoferrina, humana

781, 78,1, 7,81

COX1, ovina

893, 89,3, 8,93

COX2, humana

868, 86,8, 8,68

Peroxidasa tiroidea, humana

595, 59,5, 5,95

Troponina I, humana

2155, 215,5, 21,55

30

Sustancias interferentes

Se observó que las sustancias presentadas en el siguiente cuadro, al ser examinadas en plasma que contiene 3000 pmol/l y 1000 pmol/l de MPO según la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS), no interfieren hasta las concentraciones indicadas. Una desviación del 10% o menos no se consideró interferencia.

Ácido acetilsalicílico

600

Dosis tóxica

Albúmina

50000

Alta*

Amoxicilina

75

3x dosis terapéutica

Bilirrubina conjugada

50

Alta*

Bilirrubina no conjugada

150

Alta*

Captoprilo

5

Dosis tóxica

Ceruloplasmina

600

Alta

Colesterol

1000

Alta*

ADN

16,7

Alta

Fenofibrato

45

3x dosis terapéutica

Hemoglobina

5000

Hemólisis*

Heparina litio

3000 U/l

3x dosis terapéutica

Hidroclorotiazida

6

3x dosis terapéutica

Hidrocortisona

0,69

Dosis tóxica

Ibuprofeno

500

Dosis tóxica

Indometacina

36

2x dosis terapéutica

Dinitrato de isosorbida

0,15

3x dosis terapéutica

Lovastatina

53

2x dosis terapéutica

Metotrexato

160

Dosis terapéutica

Metoprolol

5

Dosis tóxica

Naproxeno

500

4x dosis terapéutica

Niacina

0,5

5x dosis terapéutica

Nifedipina

0,4

2x dosis terapéutica

Ácido salicílico

600

Dosis tóxica

Azida sódica

0,50%

5x dosis conservante

Triglicéridos

5000

Lipemia

* Concentración alta de sustancia interferente según la directiva EP7-A del CLSI (antiguamente NCCLS).

Gancho (Hook)

31

Anticuerpos interferentes

Se elaboraron modelos de regresión logística multivariante (SAS, versión 8.0, SAS Institute, EE.UU.) para calcular la relación de posibilidades y los intervalos de confianza del 95%. Las covariantes ajustadas fueron la edad, el sexo, la raza, la troponina T (≤0,03 ng/ml frente a >0,03 ng/ml)7, proteína C reactiva(<1 mg/l, de 1 a 3 mg/l, >3 mg/l)2, CK-MB (≤8,8 ng/ml en comparación con >8,8 ng/ml)7, los antecedentes de tabaquismo, los antecedentes de diabetes, los antecedentes de hipertensión y los antecedentes de colesterol elevado. La información ausente sobre covariantes en algunos pacientes redujo la población del estudio.

El riesgo de episodios cardíacos adversos mayores en todos los pacientes en los 30 días posteriores aumentó al aumentar los cuartiles de las concentraciones de mieloperoxidasa.

Un análisis similar de pacientes que fueron continuamente negativos a la troponina T (≤0,03 ng/ml) también reveló un riesgo significativamente más alto de episodios cardíacos adversos mayores en los pacientes con concentraciones de MPO en plasma en los cuartiles superiores. La razón de posibilidades ajustada y el porcentaje de pacientes con un cuartil de MPO con y sin episodios cardíacos adversos mayores a los 30 días se muestran en los siguientes gráficos y cuadros.

32

100

90

80

70

60

ECAM

50

Sin ECAM

40

30

20

0

10

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

1,0

2,5

2,8

3,3

n.d.

de 1,3 a 4,8

de 1,5 a 5,6

de 1,7 a 6,4

p = 0,007

p = 0,0021

p < 0,001

*En cada análisis, el primer cuartil sirvió como grupo de referencia.

100

90

80

70

60

ECAM

50

Sin ECAM

40

30

20

0

10

<1151

1151-1879

1880-2953

>2953

1,0

3,4

4,1

6,9

n.d.

1,2-9,4

1,5-11,4

2,5-19,2

p = 0,0194

p =0,007

p < 0,001

*En cada análisis, el primer cuartil sirvió como grupo de referencia.

Debe señalarse que los distintos valores discriminatorios pueden ser adecuados para poblaciones clínicas diferentes.

33

1. Klebanoff SJ, y cols. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, y cols. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall E, Perlman P. Immunochemistry, 1971 8(9): 871-874.

5. CLSI (antiguamente NCCLS). Document H18-A2 1999 NCCLS Wayne, PA.

6. Horn, y cols. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, y cols. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

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Este producto está cubierto por la solicitud de patente EE.UU. 20020164662.

1. Esperar que todos los reactivos, calibradores, controles y muestras de pacientes se calienten a la temperatura ambiente (de 20 a 26 ºC) durante 30 minutos como mínimo, antes de su uso.

2. Agitar en vórtice los calibradores, controles y muestras, para que se mezclen bien.

4. Pipetear 90 μl de solución amortiguadora de análisis y todas las microplacas de titulación de las muestras y controles.

6. Sellar e incubar durante 45 minutos, rotando a 500 r.p.m.

7. Lavar cuatro veces con 400 μl de solución amortiguadora de lavado de trabajo y secar para eliminar el exceso de solución amortiguadora.

8. Añadir a cada pocillo 100 μl de conjugado de anticuerpo anti-MPO (amarillo).

9. Sellar e incubar durante 45 minutos, rotando a 500 r.p.m.

10. Lavar cuatro veces con 400 μl de solución amortiguadora de lavado de trabajo y secar para eliminar el exceso de solución amortiguadora.

11. Añadir a cada pocillo 100 μl de reactivo de sustrato TMB.

12. Incubar durante 15 minutos, rotando a 500 r.p.m.

13. Añadir 100 μl de solución de parada a cada pocillo y girar para que se mezcle.

14. Leer la absorbancia a 450 nm, preferiblemente con corrección a 630 nm.

Puede ser necesario colocar los calibradores y los controles en posiciones diferentes, según el número de muestras analizadas.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

CAL A

2

6

9

13

17

20

24

28

CTL3

35

39

B

CAL B

3

7

10

14

18

21

25

29

CTL3

36

40

C

CAL C

3

CTL1

10

14

18

21

25

29

32

36

40

D

CAL D

4

CTL1

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL A

E

CAL E

4

7

11

15

19

22

26

30

33

37

CAL B

F

1

5

8

12

16

20

23

27

31

34

38

CAL C

G

1

5

8

12

16

CTL2

23

27

31

34

38

CAL D

H

2

6

9

13

17

CTL2

24

28

32

35

39

CAL E

35

Kit de réactifs pour dosage immunoenzymatique

L’activation des leucocytes stimule la sécrétion de MPO et la production d’oxydants1. Plusieurs sources de données indiquent que l’enzyme myéloperoxydase (MPO), sécrétée par les leucocytes, participe à l’évolution de l’athérosclérose et favorise la fragilité de la plaque2,3. La MPO a été liée au ramollissement de la plaque lipidique, à l’activation des cascades de protéases affectant la stabilité et la thrombogénécité de la plaque, à la production de lipides oxydés cytotoxiques et prothrombogéniques, et à la consommation de monoxyde d’azote, ce qui entraîne une vasoconstriction.3

La concentration plasmatique de MPO dans les échantillons de patients prélevés au cours de la période d’évaluation dans le contexte d’un syndrome coronaire aigu à l’urgence est un facteur prédictif du risque d’événements cardiaques indésirables majeurs (ÉCIM) — dont l’infarctus du myocarde, le besoin de revascularisation ou le décès — au cours des 30 jours suivants et des 6 mois suivants2. Le risque relatif approché d’ÉCIM augmente proportionnellement aux taux plasmatiques de MPO dans tous les quartiles de la population. La valeur prédictive de la concentration de MPO est indépendante de l’âge, du sexe, de l’appartenance ethnique, du taux de CRP, du taux de troponine T, du taux de CK-MB et des antécédents de diabète, de tabagisme, d’hyperlipidémie et d’hypertension.

36

Les calibrateurs sont ajoutés directement aux puits appropriés de la microplaque. Le tampon de dosage est ajouté à tous les puits destinés à l’analyse du contrôle ou de l’échantillon. Des parties aliquotes de contrôles ou d’échantillons sont ajoutées aux puits appropriés et la plaque est incubée pendant 45 minutes entre 20 et 26 °C. Les puits sont ensuite lavés avec un tampon de lavage pour éliminer les antigènes qui ne sont pas liés spécifiquement à l’anticorps immobilisé.

Un anticorps monoclonal anti-MPO marqué à la peroxydase de raifort (HRP) est alors ajouté à chaque puits et incubé pendant 45 minutes entre 20 et 26°C. L’anticorps conjugué se lie à la MPO adsorbée sur la plaque, puis la MPO de l’échantillon est « mise en sandwich » entre l’anticorps de la phase solide et l’anticorps conjugué. La plaque est lavée de nouveau avec le tampon de lavage pour éliminer les anticorps marqués à la HRP non liés.

Le substrat, la tétraméthylbenzidine (TMB), est alors ajouté à chaque puits et, pendant l’incubation de 15 minutes entre 20 et 26°C, la solution se colore en bleu. La coloration est arrêtée par l’ajout de la solution d’arrêt, ce qui colore le tout en jaune.

La quantité d’enzyme utilisée par le substrat, qui est mesurée spectrophotométriquement à 450 nm, préférablement avec une correction de 630 nm, est directement proportionnelle à la concentration de MPO. Les absorbances des calibrateurs sont utilisées pour tracer une courbe d’étalonnage de l’absorbance par rapport à la concentration de MPO, laquelle permet de déterminer la concentration de MPO dans les contrôles ou les échantillons.

Matériel fourni avec le kit:

Microplaque enduite d’anticorps monoclonaux murins anti-MPO, 12 rangées de 8 puits

Solution saline tamponnée au citrate contenant des détergents et des additifs.

Solution jaune d’anticorps monoclonaux murins anti-MPO conjugués à l’HRP.

Solution aqueuse d’acide sulfurique (0,4 N) Tenir bien fermée.

Solution saline tamponnée au Tris contenant des détergents.

MPO en tampon de phosphate avec protéines, détergents et stabilisateurs. Pour connaître les concentrations réelles, voir les étiquettes de chaque calibrateur.

38

Les kits de tests non ouverts doivent être réfrigérés (entre 2 et 8 °C) dès leur réception et jusqu’à leur date de péremption. Les bandes de puits de microtitrage non utilisées doivent être conservées scellées dans un sachet en pellicule d’aluminium, avec un produit déshydratant, entre 2 et 8 °C. Les kits de tests non ouverts, stockés comme indiqué, restent stables jusqu’à la date de péremption figurant sur l’étiquette. Les réactifs présentant des signes de décoloration, de turbidité, de précipité ou de fuite ne doivent pas être utilisés.

39

Remarques sur la procédure

1. Attendre au moins 30 minutes pour laisser les réactifs, les échantillons, les calibrateurs et les contrôles atteindre la température ambiante (20 à 26 °C) avant de les utiliser.

2. Passer les échantillons, les calibrateurs et les contrôles au vortex pour bien les mélanger. Éviter la formation de mousse.

3. Retirer le cadre des bandes de puits et le nombre voulu de bandes de microtitrage enduites du sachet en pellicule d’aluminium après avoir laissé la plaque atteindre la température ambiante (20 à 26 °C). Mettre les bandes de puits non utilisées dans le sachet en pellicule d’aluminium avec le produit déshydratant, resceller et conserver entre 2 et 8 °C.

4. Utiliser un nouvel embout de pipette en polypropylène pour chaque réactif, calibrateur, contrôle ou échantillon afin d’éviter la contamination.

5. Le dosage de tous les calibrateurs, les contrôles et les échantillons doit être répété deux fois.

6. Avant l’addition du conjugué d’anticorps anti-MPO et du réactif de substrat TMB, s’assurer qu’il n’y a pas de résidu de tampon de lavage dans les puits. Toute trace de tampon de lavage dans les puits peut causer des variations des résultats des tests.

7. Pour obtenir des mesures exactes, l’ajout d’échantillon, de calibrateurs et de contrôles doit se faire avec précision. Pipetter avec soin en utilisant uniquement des appareils calibrés.

8. Tous les composants des kits, à l’exception du concentré de tampon de lavage, sont fournis prêts à l’emploi. Se reporter au protocole ci-dessous pour préparer la solution de tampon de lavage.

Préparation du tampon de lavage à 1X

Laisser le concentré de tampon de lavage atteindre la température ambiante (20 à 26 °C) avant de l’utiliser. Préparer le tampon de lavage 1X en versant le flacon de concentré de tampon de lavage à 25X fourni dans un récipient propre de 1 litre. Rincer le flacon avec de l’eau désionisée de type 1 pour retirer le tampon résiduel et dissoudre les cristaux. Ajouter l’eau de rinçage, diluer avec de l’eau désionisée de type 1 pour obtenir un volume total de 1 litre et bien mélanger. Si le tampon de lavage à 1X est conservé entre 2 et 8 °C, il est stable pendant 2 mois.

40

Préparation de la plaque

Incubation des échantillons

3. Après le dernier lavage, tapoter la plaque contre du papier absorbant pour retirer le tampon de lavage qui pourrait rester. Ne pas laisser les puits sécher. Procéder immédiatement à l’étape suivante.

Incubation de l’anticorps conjugué

4. Après le dernier lavage, tapoter la plaque contre du papier absorbant pour retirer le tampon de lavage qui pourrait rester. Ne pas laisser les puits sécher. Procéder immédiatement à l’étape suivante.

Incubation du substrat et développement de la couleur

Arrêt et lecture

2. Faire tourner doucement la plaque sur une surface plane pour mélanger. S’assurer que toute la couleur bleue est devenue jaune.

3. Lire la densité optique à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque. Il est recommandé d’effectuer une correction d’arrière-plan à 630 nm.

41

1. Tracer une courbe d’étalonnage à l’aide d’un logiciel approprié. Une courbe à quatre paramètres est recommandée. Les calculs manuels peuvent être effectués en reportant l’absorbance moyenne obtenue pour chaque calibrateur sur l’axe des y pour chaque concentration de MPO (pmol/l) sur l’axe des x.

2. En utilisant la valeur d’absorbance moyenne pour chaque échantillon et contrôle, déterminer la concentration correspondante de MPO en pmol/l à l’aide de la courbe d’étalonnage. Le taux de MPO attribué à chaque calibrateur reflète l’utilisation du volume d’échantillon de 10 μl (une dilution de 1/10 dans la plaque), de sorte qu’il est inutile de faire d’autres calculs.

3. Les échantillons dont les taux de MPO dépassent la valeur maximale des calibrateurs peuvent être rapportés comme étant supérieurs à ce taux de calibrateur, par exemple > 8 000 pmol/l. Il n’est pas recommandé de diluer davantage les échantillons.

42

Les résultats d’une courbe d’étalonnage typique utilisant les relevés de densités optiques à 450 nm avec une correction à 630 nm sont indiqués sur l’axe des y par rapport à des concentrations de MPO (pmol/l) sur l’axe des x. L’utilisateur doit déterminer une nouvelle courbe d’étalonnage pour chaque test réalisé. La courbe d’étalonnage suivante est donnée uniquement à titre d’exemple.

A

8 020

2,630

B

3 650

2,000

C

1 580

1,108

D

490

0,346

E

0

43

Protocole

Interprétation clinique

Le taux médian de MPO des sujets de la base de données ajustée était de 340 pmol/l et la plage des résultats était comprise entre 137 et 984 pmol/l. La distribution non paramétrique des taux de myéloperoxydase dans cette population normale donne un intervalle de référence de 95 % central bilatéral, corrigé pour tenir compte de l’influence du rejet des aberrations, compris entre 156 et 734 pmol/l. Cependant, dans cette application, l’intervalle de référence de 95 % inférieur bilatéral plus approprié, corrigé de nouveau pour tenir compte de l’influence du rejet des aberrations, est < 640 pmol/l.

44

Sensibilité

La limite de détection minimale, calculée par l’interpolation de la moyenne plus deux écarts-types de 26 réplicats du calibrateur (E) MPO à 0 pmol/l, est de 14 pmol/l MPO.

Précision du dosage

La précision totale et la précision entre chaque dosage ont été déterminées en testant 6 échantillons tests de plasma avec héparine de lithium contenant des concentrations de MPO couvrant toute la plage d’étalonnage du dosage, selon la directive EP5-A du CLSI (anciennement NCCLS). Ces échantillons ont été dosés en double, en utilisant un seul lot de réactifs et de calibrateurs, sur deux plaques séparées par jour, pendant 20 jours. Une nouvelle courbe d’étalonnage a été exécutée en double sur chaque plaque. Les résultats de l’étude de précision sont résumés au tableau suivant.

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 1

307

80

10,2%

5,8%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 2

610

80

5,8%

5,0%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 3

1 285

76*

7,4%

5,7%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 4

1 459

80

8,9%

8,6%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 5

2 745

80

9,0%

9,0%

Échantillon de plasma avec héparine de lithium 6

4 758

80

8,7%

6,4%

Moyenne

8,3%

6,7%

*Les données de 1 jour ont été exclues de l’analyse à cause de résultats très aberrants

45

Linéarité

Récupération après ajout

Neuf échantillons de plasma traités à l’héparine de lithium ont été additionnés de 497, 1 456 et 2 851 pmol/l de MPO et analysés pour évaluer la récupération. Le pourcentage de récupération a été calculé en divisant la concentration moyenne de MPO mesurée dans l’échantillon additionné de MPO par la concentration prévue de MPO; la concentration prévue de MPO correspond à la somme de la concentration de MPO mesurée dans l’échantillon contenant seulement du plasma et de la concentration de MPO dans l’échantillon additionné de MPO. La récupération moyenne de MPO additionnée dans le plasma avec héparine de lithium était comprise entre 87 % et 117 %, la moyenne étant de 100,7 %.

Récupération par dilution

Neuf échantillons de plasma avec héparine de lithium ont été additionnés de 2 851 pmol/l de MPO et dilués à 1:2, 1:4 et 1:8 avec du tampon de dosage. Le pourcentage de récupération a été calculé en divisant la concentration moyenne de MPO dans l’échantillon prédilué, multiplié par le facteur de dilution, par la concentration moyenne de MPO dans l’échantillon non prédilué. La récupération moyenne d’une dilution de 1:2 était de 113 % pour le plasma avec héparine de lithium, les taux de récupérations étant compris entre 107 % et 117 %.

46

Réactivité croisée

Les réactifs pouvant faire l’objet de réaction croisée cités au tableau suivant ont été testé dans du plasma traité à l’héparine de lithium, conformément à la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLIS). Toutes les protéines étudiées, ajoutées à un regroupement de plasma traité à l’héparine de lithium, ont présenté une réactivité croisée inférieure à 0,007 % lors que la concentration du test était élevé, et inférieure à 1,7 % lorsque la concentration du test était faible.

Substance testée

Concentrations testées (nmol/l)

1 250; 125; 12,5

Protéine C-réactive humaine

543; 54,3; 5,43

Lysozyme humain

4 464; 446,4; 44,64

IgA humaine

417; 41,7; 4,17

Élastase humaine

2 500; 250; 25

Peroxydase éosinophile humaine

887; 88,7; 8,87

Lactoperoxydase bovine

801; 80,1; 8,01

Lactoferrine humaine

781; 78,1; 7,81

COX1 ovin

893; 89,3; 8,93

COX2 humain

868; 86,8; 8,68

Peroxydase thyroïde humaine

595; 59,5; 5,95

Troponine I humaine

2 155; 215,5; 21,55

47

Substances interférentes

Les substances figurant dans le tableau suivant, qui ont été testées dans du plasma contenant 3 000 pmol/l et 1 000 pmol/l de MPO selon la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLS), n’étaient pas interférentes, et ce, jusqu’aux concentrations indiquées. Une erreur systématique de 10 % ou moins n’était pas considérée comme interférente.

Acide acétylsalicylique

600

Dose toxique

Albumine

50 000

Taux levé*

Amoxicilline

75

3 × dose thérapeutique

Bilirubine conjuguée

50

Taux levé*

Bilirubine non conjuguée

150

Taux levé*

Captopril

5

Dose toxique

Céruloplamine

600

Taux levé*

Cholestérol

1 000

Taux levé*

ADN

16,7

Taux levé*

Fénofibrate

45

3 × dose thérapeutique

Hémoglobine

5 000

Hémolyse*

Héparine, lithium

3 000 U/L

3 × dose thérapeutique

Hydrochlorothiazide

6

3 × dose thérapeutique

Hydrocortisone

0,69

Dose toxique

Ibuprofène

500

Dose toxique

Indométhacine

36

2 × dose thérapeutique

Dinitrate d’isosorbide

0,15

3 × dose thérapeutique

Lovastatine

53

2 × dose thérapeutique

Méthotrexate

160

Dose thérapeutique

Métoprolol

5

Dose toxique

Naproxène

500

4 × dose thérapeutique

Niacine

0,5

5 × dose thérapeutique

Nifédipine

0,4

2 × dose thérapeutique

Acide salicylique

600

Dose toxique

Azide de sodium

0,50 %

5 × dose de conservation

Triglycérides

5 000

Lipémie

* Taux élevé de substance interférente selon la directive EP7-A du CLSI (anciennement NCCLS)

Effet de crochet

48

Anticorps interférents

Des modèles de régression logistiques à plusieurs variables (version SAS 8.0, SAS Institute) ont été établis pour calculer les risques relatifs approchés et les intervalles de confiance à 95 %. Les covariables ajustées comprenaient l’âge, le sexe, l’appartenance ethnique, le taux de troponine T (≤ 0,03 ng/ml vs > 0,03 ng/ml)7, le taux de protéine C-réactive (< 1 mg/l, 1-3 mg/l, > 3 mg/l)2, le taux de CK-MB (≤ 8,8 ng/ml vs > 8,8 ng/ml)7, les antécédents de tabagisme, les antécédents de diabète, les antécédents d’hypertension et les antécédents d’hypercholestérolémie. Des informations au sujet de covariables manquantes sur certains sujets ont réduit la population de l’étude. Le risque d’ÉCIM chez tous les patients pendant la période suivante de 30 jours a augmenté proportionnellement aux quartiles des taux de myéloperoxydase.

Une analyse semblable portant sur des patients présentant des taux constamment négatifs de troponine T (≤ 0,03 ng/ml) a révélé également un risque significativement plus élevé d’ÉCIM chez les patients dont les taux plasmatiques de MPO se situaient dans les quartiles plus élevés. Les risques relatifs approchés ajustés et le pourcentage de patients séparés par un quartile de MPO, présentant ou pas des ÉCIM à 30 jours sont indiqués aux graphiques et tableaux suivants.

49

1,0

2,5

2,8

3,3

S/O

1,3-4,8

1,5-5,6

1,7- 6,4

p = 0,007

p = 0,0021

p < 0,001

*Dans chaque analyse, le premier quartile a servi de groupe de référence

1,0

3,4

4,1

6,9

S/O

1,2-9,4

1,5-11,4

2,5-19,2

p = 0,0194

p = 0,007

p < 0,001

*Dans chaque analyse, le premier quartile a servi de groupe de référence

Notons qu’il conviendrait d’avoir différentes valeurs seuils en fonction de chaque

population clinique.

100

90

80

70

60

ECIM

50

Non ECIM

40

30

20

0

10

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ECIM

Non ECIM

<1 151

1 151-1 879

1 880-2 953

>2 953

50

-1146.

-874.

, PA.

2. Brennan ML

5. CLSI (anciennement NCCLS). Document H18-A2 1999 NCCLS Wayne

Ce produit est garanti pour l’usage qui est décrit sur sa documentation officielle

et dans la documentation de Progn r ce produit, à condition qu’il soit

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Prog

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Pays-Bas

51

MC

CardioMPO

Kit de réactifs pour dosage

immunoenzymatique

1. Attendre au moins 30 minutes pour que les réactifs, les calibrateurs, les

contrôles et les échantillons de patient aient atteint la température ambiante

(20 à 26 °C) avant de les utiliser.

2. Passer les calibrateurs, les contrôles et les échantillons au vortex pour bien

les mélanger.

microtitrage appropriés.

4. Pipetter 90 μl de tampon de dosage dans tous les puits de microtitrage

d’échantillon et de contrôle.

puits de microtitrage appropriés.

6. Sceller et incuber pendant 45 minutes, en faisant tourner à 500 tr/min.

7. Laver 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage et tapoter contre du papier

absorbant pour retirer l’excès de tampon.

8. Ajouter 100 μl de conjugué d’anticorps anti-MPO (jaune) dans chaque puits.

9. Sceller et incuber pendant 45 minutes, en faisant tourner à 500 tr/min.

10. Laver 4 fois avec 400 μl de tampon de lavage et tapoter contre du papier

absorbant pour retirer l’excès de tampon.

11. Ajouter 100 μl de réactif de substrat TMB dans chaque puits.

12. Incuber pendant 15 minutes, en faisant tourner à 500 tr/min.

13. Ajouter 100 μl de solution d’arrêt à chaque puits et tourner pour mélanger.

14. Lire l’absorbance à 450 nm, préférablement avec une correction à 630 nm.

Les calibrateurs et les contrôles peuvent devoir être positionnés différemment

selon le nombre d’échantillons dosés.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A CAL A 2 6 9 13 17 20 24 28 CTL3 35 39

B CAL B 3 7 10 14 18 21 25 29 CTL3 36 40

C CAL C 3 CTL1 10 14 18 21 25 29 32 36 40

D CAL D 4 CTL1 11 15 19 22 26 30 33 37 CAL A

E CAL E 4 7 11 15 19 22 26 30 33 37 CAL B

F 1 5 8 12 16 20 23 27 31 34 38 CAL C

G 1 5 8 12 16 CTL2 23 27 31 34 38 CAL D

H 2 6 9 13 17 CTL2 24 28 32 35 39 CAL E

52

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

quantitativen

er

klini

Patie en, bei denen das Risiko eines schweren

Reva nd Tod, besteht.

ung

von n Arbeiten lässt sich schließen, dass das

arth gt ist und zur Plaquevulnerabilität

wäh yndrom entnommen wurden,

gnisses

wendigkeit

Sandwichmetho zur tim g MPO nzentratio H np D

um eine effizien Ve ng d H hab zu äh ste

Bestimmung von Myeloperoxidase in Humanplasma, das in Kombination mit dschen Vorgeschichte, EKG und kardialen Biomarkern herangezogen wird, um nten mit Thoraxschmerz auszuwert

kardiovaskulären Ereignisses, einschließlich Myokardinfarkt, Notwendigkeit einer skularisierung u

Die Aktivierung von Leukozyten stimuliert die Sekretion von MPO und die Bild Oxidantien1. Aus verschiedene

Enzym Myeloperoxidase (MPO), das von den Leukozyten sezerniert wird, an der erosklerotischen Progression beteili2.3

beiträgt. MPO wurde mit der Entwicklung folgender Ereignisse assoziiert:

Entwicklung fettreicher weicher Plaque, Aktivierung von Protease-Kaskaden, diedie Stabilität und Thrombogenizität von Plaques beeinträchtigen, Bildung toxischer und prothrombogener oxidierter Li

zytopide und Verbrauch von Stickoxid, was zur Vasokonstriktion führt3.

Die MPO-Konzentration in Plasmaproben von Patienten, die im Notdienst rend der Untersuchung auf akutes Koronars

gibt Auskunft über das Risiko eines schweren kardiovaskulären Erei

(major adverse cardiac events, MACE), wie z.B. Myokardinfarkt, Not

einer Revaskularisierung oder Tod, für den Zeitraum der nächsten 30 Tage und 6 Monate2. Das Risikoverhältnis (Odds-Ratio) für MACE steigt in allen Quartilen

der Population mit steigenden MPO-Plasmaspiegeln an. Die Vorhersagekraft der

MPO-Konzentration ist unabhängig von Alter, Geschlecht, Rasse, CPR-Stufe,

Troponin-T-Spiegel, CK-MB-Spiegel, anamnestisch Diabetes, Raucher, Hyperlipidämie und Hypertonie.

er

R

enz

Kit

eine

zym

uno

say

est4

ch der

de

Bes

mun

der

-Ko

n in

uma

lasma.auch

er

ntroPO

Kit und der Reage

Kit sind zum Gebber

relief

it d

zien

it be

mt

rde

para

te

rpacku

un

and

ung

gew

rlei

jeweilig

gebrauc

zien-Kit. Die tatsächlichen Konzentrationsbereiche

ligen Kontrollen zu entnehmen. Kontrollen werden in

erden dann mit Waschpuffer gewaschen

isierten Antikörper gebunden

sind, zu entfernen.

uf der

amethylbenzidin (TMB) zugegeben

llen

t enthält 5 KalibratoreKit. Die tatsächliche K

en Kalibratoretiketten zu entnehmen. Kalibratoren werden hsfertig geliefert.

D

der gleichen Weise wie Patientenproben verarbeitet. Kalibratoren werden den entsprechenden Kavitäten in der Mikrotiterplatte direkt zugefügt. Zu allen Kavitäten, die zur Analyse der Kontrollen und Proben bestimmt sind, wird Assaypuffer gegeben. Aliquoten der Kontrollen oder Proben werden in die entsprechenden Kavitäten gegeben und die Platte wird 45 Minuten bei 20-26 °C inkubiert. Die Kavitäten w

um Antigene, die nicht spezifisch an den immobil

Nun wird in jede Vertiefung ein Anti-MPO monoklonaler Antikörper, der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) markiert ist, gegeben und 45 Minuten bei 20-26 °C inkubiert. Dieser konjugierte Antikörper bindet an die MPO, die aPlatte eingefangen ist und die MPO in der Probe wird sandwichartig zwischendem Antikörper in der Festphase und dem Antiköperkonjugat gebunden. Die Platte wird erneut mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundenen HRP-markierten Antiköper zu entfernen. Nun wird jeder Vertiefung das Substrat, Tetr

und für 15 Minuten bei 20-26 °C inkubiert, wobei sich eine blaue Farbe entwickelt. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stop-Lösung angehalten und die Farbe schlägt nach gelb um. Die enzymatische Umsetzung des Substrats wird spektrophotometrisch bei 450 nm, vorzugsweise mit Korrektur bei 630 nm, bestimmt und ist der MPO-Konzentration direkt proportional. Mit Hilfe der Absorptionen der Kalibratoren wird durch Auftragen der Absorptionen gegen die MPO-Konzentration eine Kalibrationskurve erstellt, mit der sich die MPO-Konzentrationen in den Kontrooder Proben ermitteln lassen.

nd Wasserstoffperoxid.

Detergenzien. und Stabilisatoren. Die

n für Volumen zwischen 10 μl und 1000 μl

tes Wasser

•

•

bei 630 nm

MPO-Konzentration aus der optischen Dichte der Kalibratoren berechnet

werden kann (optional).

Absorbierende Papiertücher Mikroplattenwaschgerät

55

•

•

nz enthält 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB).

er spülen.

ofort mit reichlich Wasser spülen und sofort

rt mit Seife und Wasser spülen. Bei Exposition der

ich Wasser spülen und sofort ärztliche Hilfe aufsuchen.

Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht verwenden.

•

ontrollen mitführen. Falls die Werte der Kontrollen nicht

i

Ung

Verf

werd i

m auf dem Etikett

ge ung,

eit aufweisen, nicht benutzen.

t lröhrchen mit Hilfe von aseptischen

kopfdrehen gründlich mischen. Lithiumauf

2-8 °C gebracht werden und bis

fbewahrt werden. Plasma muss unter

e p

20-2 nnen die Assays innerhalb von 8 Stunden nicht

rt werden.

Alle Plasmaproben müssen wie potentiell infektiöses Material behandelt werden.

•

Es muss eine sachgemäße Handhabung und Entsorgung gemäß den örtlichen, staatlichen und Bundesvorschriften erfolgen.

Bei Hautkontakt den betroffenen Bereich sofort mit Seife und WassBei Exposition der Augen s

ärztliche Hilfe aufsuchen.

Die Stop-Lösung enthält 0,4 N Schwefelsäure. Bei H

betroffenen Bereich sofo

Augen sofort mit reichl

•

LZIEN eöffnete Test-Kits müssen nach Erhalt gekühlt bei (2-8 °C) bis zum allsdatum gelagert werden. Nicht gebrauchte Mikrotiter-Kavitäten-Streifen en mit Trockenmittel versiegelt im Folienbeutel bei 2-8 °C gelagert. Be

Lagerung gemäß Anleitung bleiben ungeöffnete Test-Kits bis zuangebenen Verfallsdatum stabil. Reagenzien, die Anzeichen einer Verfärb

Trübung, eines Niederschlags oder einer Undichtigk

Bluproben sollten in Lithium-Heparin-Samme

Venenpunktionsmethoden entnommen werden. Um akkurate Ergebnisse zu

gewährleisten, Proben durch über

Heparin-Proben müssen sofort auf Eis oderzur Auftrennung bei 2-8 °C au

Zuhilfenahme einer Standardabtrennmethode, vorzugsweise in einer gekühlten rifuge, von d

Richtlinien5 wird eine maximale Zeitdauer von 2 Stunden nach Entnahme mfohlen. Plasma darf nach der Abtrennung nicht länger als 8 Stunden bei 6 °C aufbewahrt werden. Kö

abgeschlossen werden, muss das Plasma gekühlt (2 bis 8 °C) gelage

56

abgetrennte Plasma

asma eingefroren bei -15°C oder

nicht wiederholt eingefroren und

Verf

Assays nach 8 Tagen nicht abgeschlossen oder muss das länger als 8 Tage aufbewahrt werden, ist das Pl

darunter zu lagern. Plasmaproben dürfen

Plasmaspiegel sind nachweislich über 2 Einfrier-/Auftauzyklen stabil.

TESTVERFAHREN ahrenshinweise

1. eagenzien, Proben, Kalibratoren und Kontrollen vor Gebrauch für indestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (20–26 °C) bringen. roben, Kalibratoren und Kontrollen durch Vortexen gründlich vermischen.ng vermeiden. Rm

2. P

Schaumbildu

W

S

MS

l zurücklegen,

w

F e

P en.

Alle Kalibratore

g

6. V enz

itäten

n Waschpuffers können zu

isse führen.

folgendem Verfahren hergestellt.

1X Zubereitung des Gebrauchswaschpuffers

3. enn die Platte Raumtemperatur (20–26 °C) erreicht hat, den Kavitäten-treifenrahmen entfernen und die benötigte Anzahl beschichteter ikrotiterstreifen aus dem Folienbeutel entnehmen. Nicht benutzte Kavitäten-

treifen in den Folienbeutel mit darin enthaltenem Trockenmitte

ieder versiegeln und bei 2-8 ºC aufbewahren.

4.ür jedes Reagenz, jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder Probe eine neuolypropylen-Pipettenspitze verwenden, um Kontaminierung zu vermeid

5. n, Kontrollen und Proben sollten als Doppelbestimmung emessen werden. or dem Zusatz von Anti-MPO-Antikörperkonjugat und TMB-Substratreagdarauf achten, dass sich keine Reste von Waschpuffer mehr in den Kav

befinden. Kleinste Mengen noch anwesendeVeränderungen der Testergebn

7. Um genaue Messungen zu erzielen, muss die Zugabe der Proben, Kalibratoren und Kontrollen sehr präzise erfolgen. Vorsichtig und nur mit kalibrierten Geräten pipettieren. 8. Alle Kit-Komponenten, außer dem Waschpufferkonzentrat, werden gebrauchsfertig geliefert. Die Lösung des Gebrauchswaschpuffers wird nach fferreste zu

teten

sind.

3. 10 μl gut gemisch

Kavitäten pipettieren.

Probeninkubation Platte mit dem mitgelieferten Plattenversiegler versiegeln und auf e 1. inem

l

g

3.

bklopfen. Die Kavitäten

Ant

nicht austrocknen lassen. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. ikörperkonjugat-Inkubation

3. 0 μl

ch dem letzten Waschvorgang

4. n

apiertüchern abklopfen. Die Kavitäten

.

Sub

die Kavitäten aspirieren. Zur Enfernung jeglicher Reste von Waschpuffer die Platte nach dem letzteWaschschritt auf absorbierenden P

nicht austrocknen lassen. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahrenstratinkubation und Farbentwicklung

2. Auf einem Plattenschüttler bei 500 U/min (rpm) bei Raumtemperatur (20-26 °C) inkubieren. Anhalten und Ablesen

Eine Hintergrundkorrektur bei 630 nm wird empfohlen.

58

g mit vier Parametern empfohlen.

pmol/l aus der Kalibrationskurve

PO-Konzentration, die jedem Kalibrator zugewiesen ist,

in

3. rationen, die über dem höchsten Kalibratorwert

e

1. Mit Hilfe der entsprechenden Computer Software eine Kalibrationskurve erstellen. Es wird eine Kurvenanpassun

Manuelle Berechnungen können durch Auftragen der für jeden Kalibrator erhaltenen mittleren Absorption auf der y-Achse gegen die MPO-Konzentration (pmol/l) auf der x-Achse vorgenommen werden.

2. Mit Hilfe des mittleren Absorptionswertes für jede Probe und Kontrolle wird die entsprechende MPO-Konzentration in

ermittelt. Die M

entspricht dem Gebrauch einer Probenmenge von 10 μl (1:10 Verdünnungder Platte), so dass keine weiteren Berechnungen notwendig sind. Proben mit MPO-Konzent

er

ionskurve

Zweck der

Die Ergebnisse einer typischen Kalibrationskurve zeigen die abgelesenenO.D.-Werte bei 450nm mit Korrektur bei 630 nm auf der y-Achse, aufgetragen gegen die MPO-Konzentrationen (pmol/l) auf der x-Achse. DBenutzer sollte für jeden durchgeführten Test eine neue Kalibraterstellen. Die folgende Kalibrationskurve dient ausschließlich dem

B 3650 2,000 C 1580 1,108 D 490 0,346

E 0 0,031

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

60

Verf

ahren Verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse sind nur durch sorgfältige Einhaltung der in dieser Packungsbeilage beschriebenen Vorgehensweisen und Befolgung der Sicherheitsbestimmungen Ihres Labors gewährleist. Dabei sind die Wasch

•

führt zu schlechter Präzision und falsch erhöhten o

Absorptionsme

einer Interf z durch hetero ntikörper wie hum i-

Mausantikö (HAMA), deren Anwesenheit in Proben z erhöhten

oder falsch erniedrigten Werten führen könnte.

führen.

der erniedrigten

sswerten.

rantikörper

eht auch hier die Möglichke

eren

phile A

ane Ant

rper

u falsch

tore

Verfah

dem

falsche

parametrische Verteilung der Myeloperoxidase-Konzentrationen in dieser

normalen Population ergibt nach der Eliminierung von Ausreißern ein zweiseitiges

zentrales 95% Referenzintervall von 156 – 734 pmol/l. Das bei dieser Applikation

eher angebrachte einseitige untere Referenzinterval ist jedoch ebenso nach

Eliminierung der Ausreißer < 640 pmol/l.

61

keit

Empfindlich

ei

Stan )

bere

Die untere Nachweisgrenze, die durch Interpolation des Mittelwertes plus zwdardabweichungen von 26 Wiederholungen des 0 pmol/l MPO-Kalibrators (Echnet wurde, ist 14 pmol/l MPO.

Assay-Präzision ion wurden bestimmt, indem 6 Lithium- Die Gesamt- sowie die Intra-Assay-Präzis

Heparin-Plasmatestproben mit über den gesamten Kalibrationsbereich des Assays

unte i

sepa jede Platte wurde eine

L

L

Lithium-Heparin-

* Die 1 Tag entsprechende Menge an Daten wurde wegen groben Ausreißern von der Analyse ausgeschlossen.

62

Linearität

Lithium-Heparin-Plasmaproben, die durch Versetzen mit MPO auf hohe MPOationen

in den Mischungen wurde mit

estimmung der Linearität gemäß den Empfehlungen in

-Richtlinie EP6-A ausgewertet. Die Linearität des

Konzentrationen gebracht wurden, wurden mit unverdünnten Plasmaproben niedriger MPO-Konzentration vermischt, um 9 MPO-Konzentrationen zu erhalten, die sich über den erwarteten linearen Bereich erstrecken und darüber hinaus gehen. Die Linearität der MPO-Konzentr

Hilfe der polynomialen Bder CLSI (ehemals NCCLS)

ng

PO-Konzentration der

ver

erw in

er unverdünnten Plasmaprobe und der Konzentration des MPO-Zusatzes

entsprach. Die durchschnittliche Wiederfindung ten M iu

rt

von 100,7 %.

Wiederfindung nach Verdünnu

setzten Probe durch die erwartete MPO-Konzentration errechnet, wobei die artete MPO-Konzentration der Summe der gemessenen MPO-Konzentration

d

zugesetzbis 117 % mit einem

POs in Lith Mittelwe

m-

Heparin-Plasma lag im B

ereich von 87 %

ng Ne n-Plasma n wurden mit 2851 pmol/l M setz

ans aypuffer 1:2, 1:4 und 1:8 verdünnt. Die prozentuale

W e durch D der mit dem Verdünnungs

multiplizierten mittleren MPO-Konzentration der vo ten Pro h die

mi tration d e ohne Vorverdünnung errechnet. Die

mittlere Wiederfindung einer 1 nnung war bei Lithium-Heparin-

Pla , wobei derfindungsw im Berei 107

117

un Lithium-Heparichließend mit Ass

probe

PO ver

t und

iederfindung wurd

ivision

faktor be durc

rverdünn

ttlere MPO-Konzen

er Prob:2 Verdü

smaproben 113 % % lagen.

die Wie

erte

ch von

Humanplasmaprobe verbundene Matrixeffekte berücksichtigt werden. PrognostiX empfiehlt keine weitere Probenverdünnung. Proben mit MPO-Konzentrationenoberhalb des Wertes für den höchsten Kalibrator sollten als größer als dieser Wert angegeben werden, z.B. > 8000 pmol/l. Eine 1:2 Verdünnung unter Verwendung von Polypropylen-Laborutensilien kann erfolgen, wenn dem Laboranten bekannt ist, dass die aus dieser Messung erhaltene MPO-Konzentration ~13 % höher als der tatsächliche Wert sein wird. Kreuzreaktivität Die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten potentiellen Kreuzreaktanten wurden den Vorschriften der CLSI (ehemals NCCLS)-Richtlinie EP7-A

ma und Assaypuffer getestet. Alle

entsprechend in Lithium-Heparin-Plas

geprüften Eiweiße zeigten nach Zugabe zu einem Lithium-Heparin-Plasmapool bei hoher Testkonzentration eine Kreuzreaktivität von weniger als 0,007 % und bei niedriger Testkonzentration eine Kreuzreaktivität von weniger als 1,7 %. Testsubstanz Testkonzentrationen (nmol/l) Humanes alpha-1-Antitrypsin 1250 125 12,5 humanes C-reaktives Protein 543 54,3 5,43 Humanes Lysozym 4464 446,4 44,64 Humanes IgA 417 41,7 4,17 Humane Elastase 2500 250 25

Humane Eosinophil-Peroxidase 887 88,7 8,87

Lactoperoxidase, Rind 801 80,1 8,01

zu

%

Acetylsalicysäure 600 Toxische Dosis

Albumin 50000 Hoch

Amoxicillin 75 3 x therapeuische Dosis

Bilirubin, konjugiert 50 Hoch Bilirubin, nicht konjugiert 150 Hoch Captopril 5 Toxische Dosis Ceruloplasmin 600 Hoch

Cholesterin 1000 ch*

HoDNA 16,7 Hoch

Fenofibrat

45 che Dosis

3 x therapeuisHämoglobin 5000 Hämolyse*

Heparin-Lithium

3000 U/l ische Dosis

3 x therapeu

Hydrochlorthiazid 6 ische Dosis

3 x therapeuHydrocortison 0,69 Toxische Dosis

Ibuprofen 500 Toxische Dosis

Indomethacin

36 peutische

sis

2 x theraDo

Isosorbiddinitrat 0,15 ische Dosis

3 x therapeu

Lovastatin 53 eutische

s

2 x thera

pDosi

Methotrexat 160 Therapeutische Dosis

Metoprolol 5 Toxische Dosis

Naproxen 500 4x therapeutische Dosis

Niacin 0,5 5x therapeutische Dosis

Nifedipin 0,4 2 x therapeutische

Dosis

Salicylsäure 600 Toxische Dosis

Natriumazid 0,50% 5x Erhaltungsdosis

Triglyzeride 5000 Lipämie

Hook-Effekt

Bis zu einer Konzentration von 1 μmol/l MPO, die ungefähr 100 mal höher ist als

das obere Ende des bestimmbaren Wertebereichs und 600mal höher als die

Test kein Hook-Effekt nachgewiesen werden.

65

Störende Antikörper

pdie

gen. Folglich konnte keine

signifikante Interferenz aufgrun RF festgestellt werden;

scheinb rationen wese

p-ANCA-Antikörpern verringert sein.

A schweren ka skulären Ereignisse en die

Konzentrationen an 0 gelagerten us einer Studie mit

P erhalb von 24 Stunden n uftritt von Tho n

N pruch nahmen, analysier eilnehmer wurden e

f onate hinweg auf das Auftr ines Myokardinfarkt

Notwendigkeit einer Revaskularisierung (K rarterienb

p narintervention oder Kath rung mit ü

Stenose in mindestens zwei großen Herzkranzgefäßen) od

P n 23 bis 96 Jahren m m mittlere

k estellung erfolgte wie zu schrieben.7 Da

schwerer kardiovaskulärer Ereignisse wurde durch Nachsorgeanrufe, die nach

3 Monaten erfolgten, bewer

Z r Risikoverhältnisse (O s) und

V tervalle wurden multivariante tische Regres

Version 8.0, SAS Institute) entwickelt. Die angepassten Kovarianten waren Alter,

Geschlecht, Rasse, Troponin T (≤0,03 ng/ . >0,03 ng/

Protein (<1 mg/l, 1-3 mg/l, >3 mg/l)2, CK-M (≤8,8 ng/m vs.

anamnestisch Raucher, Diabetes, Hyperto d hoher C

Fehlen kovarianter Information über einige enten führ

S ion. Das MACE-Risiko nahm allen Patiente

nachfolgenden 30-tägigen Zeitperiode mit steigenden Quartilen der

Myeloperoxidasekonzentrationen zu.

Eine ähnliche Analyse von Patienten, die stets Troponin T-ne

ng/ml), zeigte bei Patienten mit MPO-Plas zentrationen in de

uartilen ebenfalls ein signifikant erhöhtes MACE-Risiko. Angepasste

und Tabellen dargestellt.

d von HAMA oder können jedoch bei An

are MPO-Konzent

nheit von anti-MPO

gnostiX

bschätzung des Risikos vonMPO in 56

rdiova

n wurd

Plasmaproben a

atienten, die innns

ach A2

raxschmerzen de

otdienst in Aen 6 M

t.Die T

über di

olgend

eten eoa

s, der

ron

ypassoperation, ber 70-prozentiger

erkutane Koro

eterisie

er einehin

s Todesfalls

Tena

st a

Proben stammten von n Al

atienten im Altelinische Dignos

it einevor be

ter von 64. Die s Auftreten

a

0 Tagen und 6

tet.

ur Berechnung de

dds-Ratio

der 95 %

ertrauensin

logis

sionsmodelle (SAS

ml vs

ml)7, C-reaktives

B

>8,8 ng/ml)7,

nie un

holesterinwert. Das

Pati

te zur Reduktion der

tudienpopulat

bei

n in der

gativ 0,03

waren (≤n oberen

makon

Q

Risikoverhältnisse (Odds-Ratios) und der Prozentsatz von Patienten innerhalb eines MPO-Quartils mit und ohne MACE nach 30 Tagen sind in den folgenden

Abbildungen

66

95% KI kA 1,3-4,8 1,5-5,6 1,7- 6,4

0

p-Wert p = 0,0194 p = 0,007 p < 0,001

*Bei jeder Analyse diente das erste Quartil als Referenzgruppe

hingewiesen, dass die Cut-off-Punkte bei verschiedenen klinischen

pulationen unterschiedlich sein können.

Es wird darauf

Po

0-

2953

>2953

67

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brennan ML, et al. N Engl J Med 2003; 349: 1595-604.

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7. McErlean, ES, et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

-874.

GARANTIE Es wird garantiert, dass die Leistung dieses Produkts der auf dem Etikett und der

in Prognostix, Inc.-Litera

tur für dieses Produkt beschriebenen Leistung

entspricht, wenn die cht n auch

veröffentli

en Anweisunge

bzgl. des Gebr

s dieses

Produkts streng eingeh werden. P stix, Inc. ü mt keine w

alten

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Garantie, ausdrückliche NT JEG

r oder stillschweigender Natur,

und LEH

LICHE

UNTERSTELLTE MARKTG NGIGKEI OD KE

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TSGARANTIE

ER TAUGLICH

IT FÜR

EINEN BESTIMMTEN ZWECK AB. PROGNOSTIX, INC HAFTET UNTER KEINEN

UMSTÄNDEN FÜR IRGENWELCHE INDIREKTEN, SPEZIELLEN ODER

FOLGESCH

ÄDEN WELCHER ART AUCH IMMER. Hergestellt für:

PrognostiX, Inc.

e Avenue, Cleveland, Ohio 44106

Tel: (866) 358-9828, (216) 445-7469 (PG

Fax: (216) 444-5335

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ertre

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l: + 5

e Marke der PrognostiX, Inc.

10265 Carnegi

NX)

Autorisie

rter V

ter:

Niederlande

Te

31 (0)70 345 8

70

Fax: +31 (0)70 346 7299

68

Enzym-Immunoassay Reagenzien-Kit

vor Gebrauch

gen.

ischen.

rechenden

- und Kontrollen

pipettieren.

n.

pipettieren.

12. 15 Minuten lang bei 500 U/min (rpm) rotierend inkubieren.

13. Jeder Kavität 100 μl Stop-Lösung z gen und durch vorsichtiges

Schwenken vermischen.

14. se mit Korrektur bei 630 nm, ablesen.

Gegebenenfalls is eine andere

Anordnung der Kalibratoren un .

1 2 3 4 9 10 11 12

1. Alle Reagenzien, Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (20–26°C) brin

2. Kalibratoren, Kontrollen und Proben durch Vortexen gründlich durchm

Mikrotiterkavitäten pipettieren. 4. 90 μl Assaypuffer in alle Mikrotiterkavitäten für Proben

fü

t, je nach Anzahl der zu analysierenden Proben,

d Kontrollen zu wählen

5 6 7 8 A KAL A 2 6 9 13 17 20 24 28 KTL3 35 39

B KAL B

18 21 3 7 10

14 25 29 KTL3 36 40

C KAL C 3

KT

L1 10 14

18 21

25 29 32 36 40

D KAL D 4

KT

L1 11 15

19 22 26 30 33 37 KAL A

E KAL E 4 7 11

15 19 22 26 30 33 37 KAL B

F 1 5 8 12

16 20 23 27 31 34 38 KAL C

G 1 5 8 12 16 KTL2 23 27 31 34 38 KAL D

H 2 6 9 13 17 KTL2 24 28 32 35 39 KAL E

69

it

rischio

v

t

,

con aterosclerotica.2,3 L’enzima MPO è stato

,

ci e

prot nitrico, determinando vasocostrizione.3

ienti, durante il

una

e eventi

avversi cardiaci maggiori (MACE), cioè infarto miocardico, necessità di

e dei livelli

o,

per la misurazione

della concentrazione di MPO nel plasma uma

vengono forniti separatamente per facilitare il confezionamento e la

su iche di o fi i c at ca or o iti p i al

utilizzato per la determinazione quantitativa della mieloperossidasi nel plasma umano. Va utilizzato unitamente all‘anamnesi, all’ECG e ai biomarcatori cardiaci

nella valutazione di pazienti che presentano dolore toracico e che sono a enti avversi cardiaci maggiori, ch

di ee includono l’infarto miocardico, la necessità di rivascolarizzazione o il decesso.

BREVE DESCRIZIONE E SPIEGAZIONE tivazione dei leucociti stimola la se

L'acrezione di MPO e la produzione di ossidanti.1 Numerose evidenze suggeriscono che l'enzima mieloperossidasi (MPO)

secreto dai leucociti, partecipi alla progressione del processo aterosclerotico e tribuisca alla vulnerabilità della placca

collegato allo sviluppo della placca soffice con prevalente componente lipidica

all'attivazione dei sistemi a cascata delle proteasi che influiscono sulla stabilità e

sulla trombogenicità della placca, sulla produzione di lipidi ossidati citotossirombogenici e sul consumo di ossido

La concentrazione plasmatica di MPO in campioni ottenuti da p

azperiodo in cui sono stati tenuti in osservazione al Pronto Soccorso

per sindrome coronaria acuta, ha consentito di predire il rischio di sviluppar

rivascolarizzazione o morte, nel periodo di tempo che va dai 30 giorni fino ai 6

mesi successivi.2L’ odds ratio per MACE aumenta con l’aumentarplasmatici di MPO in tutti i quartili della popolazione. Il valore predittivo della

concentrazione di MPO è indipendente da età, sesso, razza, livello di PCR, livello di troponina T, livello di CK-MB e da un’anamnesi positiva per diabete, tabagismiperlipidemia o ipertensione.

Il kit di reagenti

Ca

è u

aggio

enzim

tico

4

no. I kit di controllo e di calibr

azione

™

von

esser

utiliz

i insi

e al

di re

genti

O™, ma

manipolazione.

ardio

-E) d

utilizz

e con

PO™

I val

effet

rela

i al c

librat

sono

dica

ll’et

tta

gni

ala d

alibr

ore. I

librat

i son

forn

ront

l’uso.

70

ss

calibratori vengono aggiunti direttamente al pozzetto appropriato della

pone del test viene aggiunto a tutti i pozzetti che si intende

isi dei campioni o dei controlli. Si aggiunge un'aliquota di

di

cato

di incubare per 45 minuti a

all’MPO trattenuto sulla piastra, e

l'MPO contenuto nel campione viene ad essere “sandwiched” tra l’anticorpo

ente

del colore dal blu al giallo.

banza dei

o monoclonale murino specifico verso

colore giallo contenente un anticorpo monoclonale murino

contiene 3 controlli (1-ttivi intervalli di conc

ono indicati sull’etichetta di ogni fiala di controllo. I controlli sono trattati allo tesso modo dei campioni ottenuti da pazienti.

I

micropiastra. Il tamutilizzare per l’anal

campione o di controllo al pozzetto appropriato e si lascia incubare la piastra per 45 minuti a 20-26° C. Successivamente, i pozzetti vengono lavati con tamponelavaggio per rimuovere gli antigeni che non si sono legati in maniera specifica all’anticorpo immobilizzato. Ad ogni pozzetto viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-MPO marcon l’enzima HRP (perossidasi) e si lascia quin

20-26° C. Questo anticorpo coniugato si lega

presente nella fase solida e l’anticorpo coniugato. La piastra viene nuovamlavata con il tampone di lavaggio per rimuovere l’anticorpo marcato con HRP che non si è legato. Il substrato, rappresentato dal cromogeno tetrametilbenzidina (TMB), viene quindi aggiunto ad ogni pozzetto e lasciato incubare per 15 minuti a 20-26° C. Al termine dell’incubazione si svilupperà un colore blu. La reazione colorimetrica viene arrestata con l’aggiunta della soluzione bloccante che provoca il viraggio

71

1) o distillata

capace di leggere a 450 nm, preferibilmente con

correzione at 630 nm

re le curve appropriate per calcolare la

o).

•

•

ere trattati come materiale

•

n accordo alle normative locali, statali e federali.

concentrazione di MPO dalla densità ottica dei calibratori (facoltativ

Carta millimetrata per la rappresentazione grafica manuale di dati (facoltativa).

Solo per uso professionale.

potenzialmente infettivo. Devono essere osservate le procedure per la corretta manipolazione e

eliminazione, i

72

la zona con

te un medico.

na con acqua e sapone. Se viene a contatto

la zona con abbondanti getti d’acqua e

o.

n

I kit non ancora aperti devono essere conservati in frigorifero (2-8° C) al

ra

non siccante

ati come indicato, i kit non ancora

ull'etichetta. Non

e presentano segni di scolorimento, torbidità, precipitati o

ontenenti litio-eparina

risul nti litio-eparina devono essere immediatamente posti

sepa

fuga

massimo di due ore dal momento del prelievo.5 Una volta separato, il plasma

iù di 8 ore. Se il saggio non potrà essere

C). È stato

™ nel plasma si mantengono stabili per 8

r viene completato entro 8 giorni o se il plasma

plasma

non te congelati e scongelati, dal momento che

scon

Se viene a contatto con la pelle, sciacquare subito la zona con acqua e sapone. Se viene a contatto con gli occhi, sciacquare subito

abbondanti getti d’acqua e consultare immediatamen

Soluzione bloccante contenente acido solforico 0,4N. Se viene

la pelle, sciacquare subito la zo

con gli occhi, sciacquare subito

consultare immediatamente un medic

momento del ricevimento e fino alla data di scadenza. Le strisce per micropiastutilizzate devono essere sigillate in un sacchetto di alluminio con es

e conservate a 2-8° C. Se vengono conservdi scadenza indicata s

aperti rimarranno stabili fino alla data utilizzare i reagenti ch

perdite.

I campioni ematici devono essere raccolti in provette c

utilizzando una tecnica sterile di prelievo venoso. I campioni devono essere mescolati accuratamente mediante inversione per garantire la precisione dei tati. I campioni contene

in ghiaccio oppure a 2-8° C e conservati a 2-8° C fino al momento della razione. Il plasma deve essere separato dalle cellule utilizzando una

procedura standard di separazione, mediante preferibilmente una centrirefrigerata. Le linee guida CLSI (precedentemente NCCLS) raccomandano un

deve rimanere a 20-26° C per non p

gioni a 2-8° C. Se il saggio non

già separato deve essere conservato per oltre 8 giorni, quest’ultimo deve essere congelato ad una temperatura pari o inferiore ai -15° C. I campioni di devono essere ripetutamen

PROCEDURA DEL SAGGIO Procedurali Note

rima dell’uso, portare i reagenti, i campioni i calibratori e i controlli a 1. P

t

2. Tm

3. Rimuovere dal sacchetto di alluminio la cornice di supporto delle strisce e il

n to la piastra a

t i striscia inutilizzata nel

sacchetto di alluminio contenente l’e

2

4. Utilizzare un n vo puntale in polipropilene per ogni reagente, calibratore,

5. ato.

6. gente

ozzetti non vi siano residui di tampone di

rniti in forma pronta all’uso. Per preparare la diluizione del tampone di

emperatura ambiente (20-26° C) per almeno 30 minuti. utti i campioni, i calibratori e i controlli devono essere accuratamente escolati mediante vortex. Evitare la formazione di schiuma.

umero richiesto di strisce rivestite dopo avere porta

emperatura ambiente (20-26° C). Riporre ognssiccante, risigillare e conservare a

-8° C. uo

controllo o campione per evitare contaminazioni. Tutti i calibratori, i controlli e i campioni devono essere analizzati in duplicPrima dell'aggiunta dell’anticorpo coniugato anti-MPO e del rea

substrato TMB, assicurarsi che nei plavaggio. La presenza di residui del tampone di lavaggio può causare

variazioni nei risultati del saggio. 7. Per garantire l’accuratezza della misurazione, i campioni, i calibratori e i controlli devono essere aggiunti in modo preciso. Pipettare con attenzione utilizzando soltanto dispositivi calibrati. 8. Tutti i componenti del kit, ad eccezione del tampone di lavaggio concentrato, sono fo

lavaggio seguire la seguente procedura.

Tampone di lavaggio diluito 1X Prima dell’uso, portare a temperatura ambiente (20-26° C ) il tampone di lavaggio concentrato. Preparare una diluizione 1X del tampone di lavaggio versando l'intero contenuto della bottiglia di tampone concentrato 25X in un cilindro pulito da un litro. Risciacquare accuratamente la bottiglia con acqdeionizzata tipo I per rimuovere il tampone residuo e per dissolvere i cristAggiungere il liquido proveniente dal risciacquo, diluire con acqua deionizzatatipo I, portando al volume finale di un litro e mescolare accuratamente. Se conservato a 2-8° C, il tampone di lavaggio diluito 1X è stabile fino a due mesiPreparazione della piastra

ua

alli.

.

iato

74

Incubazione dei campioni

1. Sigillare la piastra con il sigillatore di piastra fornito e incubare su un

re

Incubazione con l’anticorpo coniugato

3. Dopo l’ultimo lavaggio, asciugare la piastra capovolgendola su tovaglioli di carta per eliminare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti. Non lasciaseccare i pozzetti. Procedere immediatamente alla fase successiva.

2. e incubare su un

3.

o

pozzetti.

i

ente alla fase successiva.

4. Dopo l’ultimo lavaggio, asciugare la piastra capovolgendola su tovaglioli dcarta per eliminare tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti. Non lasciare seccare i pozzetti. Procedere immediatam

6° C).

2. Incubare su un agitatore per piastre impostato a 500 rpm ptemperatura ambiente (20-2

un

lo.

raccomanda di eseguire la correzione per il fondo a 630 nm.

1. zando il software appropriato. Si

to alla

CALCOLO DEI RISULTATI Costruire una curva di calibrazione utiliz

raccomanda di utilizzare un “curve fit” a quattro parametri. Il calcolo manuale può essere eseguito riportando in grafico il valore medio di assorbanza ottenuto per ciascun calibratore sull’asse delle ordinate (y) rispet

2. Utilizzando il valore medio di assorbanza di ogni campione e controllo,

anto, non sono necessari altri calcoli.

ello,

dei campioni.

tture

30 nm, sono mostrati sull’asse delle

ordinate rispetto alle co te sull’asse delle

d

determinare la corrispondente concentrazione di MPO in pmol/l dalla curva di calibrazione. Il livello di MPO assegnato a ciascun calibratore è stabilito in rapporto all’uso di un volume di 10 μl di campione (a una diluizione di 1:10 nella piastra), pert

3. I campioni che presentano livelli di MPO superiori al valore del calibratore a più alta concentrazione, possono essere riportati come superiori a quel livcioè > 8000 pmol/l. Non si consiglia un’ulteriore diluizione

ESEMPIO DI CURVA DI CALIBRAZIONE I risultati di una tipica curva di calibrazione ottenuta utilizzando le le

O.D. a 450 nm, con correzione a 6

ncentrazioni di MPO (pmol/L) mostraascisse. L’utilizzatore dovrebbe costruire una nuova curva di calibrazione a

ogni saggio. La seguente curva di calibrazione è fornita solo a scopo illustrativo.

Calibratore Livello di MPO (pmol/l) (O.D. a 450 nm, correzione a 630 nm) A 8020 2,630

B 3650 2,000 C 1580 1,108 D 490 0,346

E 0 0,031

00 8000 9000

2.5

2

1

00.5010002000300040005000600070

3

76

LIMITI cedura Pro

Si potranno ottenere risultati affidabili e riproducibili quando si esegue procedura del saggio dopo avere pienamente compreso le istr

uzioni

rbanza falsamente alti o

•

Interpreta

contenute nell’inserto della confezione e in conformità con le norme di buona pratica di laboratorio. Le procedure di lavaggio sono critiche. Un lavaggio insufficiente determi

una scarsa precisione nelle letture e valori di assobassi.

Come con un qualunque altro sistema di analisi che impieghi anticorpi di origine animale, esiste la possibilità di interferenza da anticorpi eterofili, come gli anticorpi umani anti-immunoglobuline murine (HAMA), presenti nel campione, che nella lettura potrebbe causare valori falsamente alti o bassi. Altri fattori, t

ati erronei.

altri esami diagnostici.

rischio identificati per la malattia coronarica quali ECG, si, marcatori

di necrosi miocardica, ecc.

oggetti di sesso maschile (n = 150) e femminile (n = 150), in una popolazione

di donatori apparentemente sana. È stato utilizzato uno schema per la rilevazione

dei valori aberranti e la trasformazione di Box-Cox, seguita da un metodo solido

di rilevazione dei dati aberranti, allo scopo di eliminare sette valori aberranti.6

Dal

momento che non vi era alcuna differenza significativa dei livelli di MPO in

rapporto al sesso, l’intervallo di riferimento è stato stimato considerando l’intera

popolazione, dopo avere effettuato la correzione per i valori aberranti.

I valori mediani di concentrazione di MPO dei soggetti in banca dati dopo

correzione era di 340 pmol/l e l’intervallo dei risultati era compreso tra 137 e

984 pmol/l. La distribuzione non parametrica dei livelli di mieloperossidasi in

questa popolazione normale ha prodotto un intervallo di riferimento al 95%

centrale a due code, corretto per evitare l’influenza dell’eliminazione dei valori

aberranti, pari a 156 – 734 pmol/l. Tuttavia, in questa applicazione, il limite

inferiore più appropriato dell’intervallo di riferimento al 95% a una coda, ancora

una volta corretto per eliminare l’influenza dell’eliminazione dei valori aberranti ,

è < 640 pmol/l.

i reperti

a

altri clas

anamne

Con il saggio s

77

Sensibilità

Il limite minimo di rilevazione, calcolato interpolando la media più due deviaziodard di 26 replicati del calibratore di MPO (E), 0 pmol/l, è pari a 14 pm. ni

stan ol/l di

MPO

Precisione del saggio

Larecisione generale e intra-seduta è stata determinata testando 6 campioni io-eparina contenenti concentrazioni di MPO

p

test di plasma trattato con lit

distribuite lungo l’intera gamma di calibrazione del saggio, secondo le linee guida

ti

in d

pias

in d

EP5-A della CLSI (precedentemente NCCLS). Questi campioni sono stati saggiauplicato, utilizzando un unico lotto di reagenti e calibratori, in due diverse tre al giorno, per 20 giorni. È’ stata eseguita una nuova curva di calibrazione uplicato per ogni piastra. I risultati di questi studi di precisione sono riassunti

eparina Campione 1 P

epa

eparina Campione 3

Plasma con litio

Linearità

Ai campioni di plasma con litio-eparina a cui erano stati aggiunti (“spiked”)

i nelle miscele, utilizzando la valutazione polinomiale di linearità

e guida EP6-A della CLSI (precedentemente NCCLS). Il

ato lineare nei campioni di plasma con litio-eparina

elevati livelli di MPO, sono stati mescolati con campioni puliti di plasma con bassi livelli di MPO per creare 9 concentrazioni di MPO che rientravano o superavano l’intervallo lineare atteso. È stata determinata la linearità dei valori di MPO misurat

alle concentrazioni di MPO comprese tra 14 pmol/l e 9410 pmol/l, entro 60 pmol/l o al 6% di questo intervallo. Recupero nei campioni “spiked” Nove campioni di plasma con litio-eparina sono stati “spiked” con 497, 1456, e 2851 pmol/l di MPO ed è stato analizzato il loro recupero. Il recupero percentuale è stato calcolato dividendo la concentrazione media di MPO misurata nel campione “spiked" per la concentrazione attesa di MPO, dove la concentrazione

attesa M ne

m

l’ u

Recupero nei campioni diluiti

PO era la somma della concentrazione di MPO misurata nel campio MPO aggiunto al campione. Il recupero

pulito di plasma e la concentrazione dim

edio di MPO nei ca87% e il 117% con

pioni di plasma con litio-na media del 100,7%

eparina spiked era compreso tra .

Nove campioni di plasma con litio-eparina sono stati “spiked” con 2851 pmol/l di

te diluit :4 e 1:8 con il tampone del test. Il recupero

lcolato dividendo la concentrazione media di MPO nel

moltipli r il fattore di diluizione, edia

O nel campione non sottoposto a pre-diluizione. Il recupero

e 1:2 e 13% per i c oni di on lit

ero percentuale compreso tra il 107% e il 117%.

m resenza d i un campio i plasm o. Pr

diluizio campioni. I campioni che presentano i

MPO superiori al valore del calibratore a più alta c no

erò conto del fatto la concentrazione di MPO ottenuta

on questo tipo di misurazione sarà superiore di circa il 13% rispetto al suo

MPO e successivamenpe ca

i 1:2, 1

rcentuale è statocampione pre-diluito, coP

cato pe

per la m

della

ncentrazione di Mmedio di una diluizionepup

ra del 1

ampi

plasma c

io-

atrice legati alla psconsiglia un’ulteriore

i 10 μl dne dei

ne d

a uman

ognostiX livelli d

oncentraz

ione posso

essere

riportati come superiori a quel livello, cioè > 8000 pmol/l. Tuttavia, è possibile utilizzare nel saggio una diluizione 1:2, utilizzando provette da laboratorio inpolipropilene, tenendo p

cvalore reale.

79

Reattività crociata

ella

ina

lle

ol/l)

I possibili agenti che possono determinare una reazione crociata, mostrati nseguente tabella, sono stati analizzati in plasma contenente litio-eparina secondo le linee guida EP7-A del CLSI (precedentemente NCCLS). Tutte le proteine analizzate, quando sono state aggiunte ai campioni di plasma con litio-eparraggruppati, hanno mostrato una cross-reattività inferiore allo 0,007% aconcentrazioni più alte e una cross-reattività inferiore al 1,7% alle più basse concentrazioni esaminate. Sostanze analizzate Concentrazioni analizzate (nm

Proteina C-reattiva, umana 543, 54,3, 5,43

Lisozima, umano 4464, 446,4, 44,64 IgA, umane 417, 41,7, 4,17 Elastasi, umana 2500, 250, 25 Perossidasi eosinofila, umana 887, 88,7, 8,87 Lattoperossidasi, bovina 801, 80,1, 8,01 Lattoferrina, umana 781, 78,1, 7,81 COX1, ovine 893, 89,3, 8,93 COX2, umane 868, 86,8, 8,68

Perossidasi tiroidea, umana 595, 59,5, 5,95

Troponina I, umana 2155, 215,5, 21,55

80

Sostanze che interferiscono con il saggio

o

Le sostanze mostrate nella seguente tabella, quando sono state analizzate in campioni di in plasma contenenti 3000 pmol/L e 1000 pmol/L di MPO secondo le linee guida EP7-A del CLSI (precedentemente NCCLS), hanno mostrato di non interferire con il saggio fino alle concentrazioni indicate. Una distorsione ugualeinferiore al 10% non è stata considerata come interferenza.

Acido acetilsalicilico 600 Dose

tossica

Albumina 50000

Alta*

Amoxicillina 75 dose

3 volte superiore alla.

terapeutica

Bilirubina, coniu

gata 50 Alta* Bilirubina, non-coniugata 150

Alta*

Captopril 5 Dose

tossica

Ceruloplasmina 600

Alta

Colesterolo 1000

Alta*

DNA 16,7

Alta Fenofibrato 45 la dose

.

3 volte superiore al

terapeutica

Emoglobina 5000

Emolisi*

Eparina, litio 3000 U/l dose

3 volte superiore allaterapeutica. Idroclorotiazide 6 3 volte superiore alla dose

terapeutica.

Idrocortisone 0,69 Dose tossica

Ibuprofene 500 Dose tossica

Indometacina 36 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Isosorbide dinitrato 0,15 3 volte superiore alla dose

terapeutica.

Lovastatina 53 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Metotrexato 160 Dose terapeutica

Metoprololo 5 Dose tossica

Naprossene 500 4 volte superiore alla dose

terapeutica.

Niacina 0,5 5 volte superiore alla dose

terapeutica.

Nifedipina 0,4 2 volte superiore alla dose

terapeutica.

Acido salicilico 600 Dose tossica

Azide sodica 0,50% 5 volte superiore alla dose

terapeutica.

Trigliceridi 5000 Lipemia

* Alta concentrazione di sostanza che interferisce con il saggio secondo EP7-A del

CLSI (precedentemente NCCLS)

81

Anticorpi che interferiscono con il saggio

i

eri che oscillavano

dal 37% al 43%. Quindi, non sono stat

un’in iva caus da RF; tutta apparenti

di MP idotti in pr anticorpi anti-MPO p-

Effetto gancio

TM. Il recupero medio di MPO da questi campioni era del 100% mentre i singoli recuperi oscillavano dal 96% al 109%. Dieci campioni, che si sapeva contenere gli anticorpi anti-MPO p-ANCA, hanno mostrato un recupero medio del 40% con singoli recup

e osservate evidenze in favore di ata da HAMA o esenza di

terferenza significatO possono essere r

via, i livelli ANCA.

f PO, circa 100 volte eriori rispetto al lim o

d e e 600 volte s iori rispetto al livello mediano

r nei pazienti dello studio clini

del rischio di eventi avversi cardiaci maggiori, sono stati misurati i livelli di MPO in

5 i di plasma provenienti d anca che conservava i campioni di

pazienti inclusi in uno studio. Tale s stato con

eran ronto Soccorso en ore dall’in

toracic ti per progressio

miocardico, per necessità di un interv di rivascolarizzazi nto

chirurgico di bypass coronarico, intervento coronarico percu

cateterizzazione, in presenza di stenos periore al 70

coronarici principali) o decesso nei 6 mesi cessivi. I campioni analizzati c

s erano stati otten pazienti da tà

mediana di 64 anni. La diagnosi clinica tata stabilita

precedentemente descritto.7 L’incidenza venti cardiaci avversi maggiori è

stata valutata mediante interviste tele he di follow-up

Sono stati sviluppati modelli di regressione logistica m 8.0,

SAS Institute) per calcolare odds ratio e intervalli di confidenza al 95%. Le

covariate corrette erano età, sesso, ra troponina T

>0,03 ng/ml)7, proteina C-reattiva (<1 mg/l, 1-3 mg/l, >3 m

(≤ 7, abitudine al fumo, anamne

per ipertensione, per ipercolesterolem a mancanza di in ulle

c lcuni soggetto ha deter la riduzion

popolazione dello studio. Il rischio di MACE in tutti i pazienti, nel successivo

periodo di 30 giorni, aumentava con l’aumentare dei quartili dei livelli di

Anche un’analisi simile in pazienti che erano costantemente negativi per

troponina T (≤0,03 ng/ml) ha evidenziato un rischio significativamente più alto di

MACE nei pazienti con livelli plasmatici di MPO nei quartili più alti. Gli odds ratio

corretti e le percentuali relative ai pazienti che rientravano in un quartile con e

senza MACE dopo 30 giorni sono mostrati nei grafici e nelle tabelle che seguono.

tto gancio a concentraziitsim

ino a 1 μmol/l di M

sup

e mas

ell’intervallo accettabil

uper

egistrato

co.

Card

60 campion

a una b

tudio era

dotto su pazienti che si nza del dol

o presentati al Po.

tro 24

sorgeore ne verso l’infarto

2 I partecipanti sono stati monitora

ento

one (interve

taneo o

i su

% in almeno due vasi

sucuti da

on il i 23 ai 96 anni, con un'e

è s di e

secondo quanto

fonic

a 30 giorni e a 6 mesi.

ultivariati (SAS versione

zza ,

(≤0,03 ng/ml vs. g/l)2, CK-M

B si positiva per diabete,

8,8 ng/ml vs. >8,8 ng/ml)

ia . L

formazioni s

ovariate di a

minato

e delle dimensioni della

0

1,0 3,4 4,1 6,9

IC 95% ND 1,2-9,4 1,5-11,4 2,5-19,2

Valore P p = 0,0194 p = 0,007 p < 0,001 *In ogni analisi il primo quartile costituiva il gruppo di riferimento Va notato che potrebbe essere opportuno utilizzare differenti punti di cut-off a seconda della diverse popolazioni cliniche.

83

1. Klebanoff SJ, et al. Methods Enzymol, 1984; 105: 399-403.

2. Brenna 595-604.

3. Hazen, SL. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004: 24(7): 1143-1146.

4. Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 871-874.

5. CLSI (precedentemente NCCLS). Document H18-A2 1999 NCCLS Wayne, PA.

6. Horn, et al. Clinical Chemistry 2001; 47/12: 2137-2145.

7. McErlean, ES, et al. Am J Cardiol 2000; 85: 421-426.

n ML, et al. N Eng J Med 2003; 349: 1

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l: + 57

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10

06

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)

R

ppresenta

nte Autoriz

ato:

Emergo Europa

2513 BH, The Hague i

Te

31 (0)70 345 8

0

Fax: +31 (0)70 346 7299

84

zimatico

zienti i calibratori e i

escolati

l pozzetto appropriato

della micropiastra.

4. Pipettare 90 μl di tampone de pozzetti per i campioni o per i

re su

9. Sigillare e lasciare incubare per 45 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.

10. Lavare 4 volte con 400 μl di tampon per lavaggio diluito e tamponare su

carta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso.

11. Aggiungere 100 μl di reagente substrato TMB in ciascun pozzetto.

12. Incubare per 15 minuti, ruotando la piastra a 500 rpm.

13. Aggiungere 100 μl zion ascun pozzetto, e ruotare

delicatamente per mescolar

14. Leggere a 4

Potrebbe essere necessario po i controlli in modo

differente in base al numero d

1 2 3 8 9 10 11 12

Kit di reagenti per saggio immunoen

1. Prima dell’uso, portare i reagenti, i campioni dei pa

controlli a temperatura ambiente (20-26° C) per almeno 30 minuti.

2. Tutti i campioni, i calibratori e i controlli devono essere m

l test in tutti i

e

e bloccante a ci

di solu

e.

50 nm, preferibilmente con correzione a 630 nm

sizionare i calibratori e

i campioni analizzati.

4 7

5 6 A CAL A 2 6 9

13 17 20 24 28 CTL3 35 39

B CAL B 3 7 1

0 14 18 21 25 29 CTL3 36 40

C CAL C 3 CTL1 10

14 18 21 25 29 32 36 40

D CAL D 4 CTL1

11 15 19 22 26 30 33 37 CAL A

E CAL E 4 7

11 15 19 22 26 30 33 37 CAL B

F 1 5 8 12 16 20 23 27 31 34 38 CAL C

G 1 5 8 12 16

CTL2 23 27 31 34 38 CAL D

H 2 6 9 13 17 CTL2 24 28 32 35 39 CAL E

85

SYMBOLS KEY / CLAVE DE LOS E DES SYMBOLES /

Manufactured By / Fabricado por / Fabriqué par / Hergestellt von /

Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por

Authorized Representative / Representante autorizautorisé / Autorisierter Vertreter / Rappresentante

ado / Représentant

autorizzato

In Vitro Diagnostic Medical Device / Producto sanitario para

ostic in

ivo

diagnóstico médico in vitroVitro / Appareil médical de diagnvitro / In-vitro diagnostisches medizinisches Gerät / Dispositdiagnost

ico medicale per uso in vitro e / Code de lot / Chargenbezeichnung / Batch Code / Código de lot

Codice di lotto

Expiration Date in Year-Month-Day Format / Fecha de caducidad en

formato de año-mes-día / Date de péremption en format An-Mois-Jour

cata come

/ Verfallsdatum im Format JJ-MM-TT / Data di scadenza indiAnno-Mese-Giorno peratura / Limite de

Temperature Limitation / Límite de tem

température / Temperaturbegrenzung / Limiti di temperatura

CE Mark / Marca CE / Marque CE / CE-Zeichen / Marchio CE

Consult Instructions For Use / Consulte las instrucciones de usung beac

so / Voir

hten /

le mode d’emploi pour l’utilisation / GebrauchsanweiConsultare le Istruzioni per l’uso

Catalog Number / Número de catálogo / Numéro de catalogue /

Katalognummer / Numero di catalogo

Pro t Fr igh otéj e / à e la lumière

Vo t ütz bew n eg da

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t / Pr

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nt : Coterialie

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origin

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g: En

Ursp

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terial

a Cauti / Precauci e / Mise en garde : Irritant /

Vo t: nd zi Ir e

on: Irrirsich

tantReize

ón: Irrione:

tantritant

86

Enzyme Immunoassay / Inmunoanálisis enzimático / Dosage immunoenzymatique / Enzym-Immunoassay / Saggio immunoenzimatico

Reagent / Reactivo / Réactif / Reagenz / Reagente

Kit / Equipo / Kit/ Kit / Kit

est

Anti-MPO Antibody Conjugate / Conjugado de anticuerpo anti-MPO Conjugué d’anti

/

corps anti-MPO / Anti-MPO Antikörperkonjugat /

Anticorpo coniugato anti-MPO

Stop Solution / Solución de parada / Solution d’arrêt / Stop-Lösung / Soluzione bloccante

ent / Reactivo de sustrato TMB / Réactif de

substrat TMB / TMB-Substratreagenz / Reagente substrato TMB

oplaca

de titulación, recubierta con anticuerpo anti-MPO, 96 pocillos /

Microplaque enduite d’anticorps anti-MPO, 96 puits / Mit Anti-MPOiastra

rivestita con anticorpi anti-MPO, 96 pozzetti

Microtiter plate coated with Anti-MPO Antibody, 96 wells / Micr

Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte, 96 Kavitäten / Microp

Plate sealer / Sellador de placas / Feuille scellante pour plaque / Plattenversiegler / Sigillatore di piastra

ncentrado de solución

)

25X

25X Wash Buffer Concentrate / Co

amortiguadora de lavado 25X / Concentré de tampon de lavage (25 X/ 25X Waschpufferkonzentrat / Tampone di lavaggio concentrato Contents / Contenido / Contenu / Inhalt / Contenuto

Calibrator / Calibrador / Calibrateur / Kalibrator / Calibratore

Control / Control / Contrôle / Kontrolle / Controllo

Concentration / Concentración / Concentration / Konzentration/ Concentrazione

13575 30043

3/06

88